原料乳中β-內酰胺酶的檢測

文│李瑞娜（河南省濮陽市畜產品質量安全監測檢驗中心）

牛奶因含有豐富的蛋白質、氨基酸、礦物質等營養成分，已成為人們生活中不可或缺的天然食品。高品質、無污染的牛奶在增強國民身體素質中起著重要作用。當前乳及乳制品質量安全仍存在一定問題，其中最突出的是抗生素的殘留。為了掩蔽抗生素的使用，一些不法分子在原料乳中添加β-內酰胺酶這一物質，以降解已使用的抗生素，使之無法檢出。2009年全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項小組明確指出β-內酰胺酶為乳與乳制品掩蔽抗生素的違法添加非食用物質之一。新國標《生鮮牛乳收購標準》中，把“抗生素殘留”作為了必檢項目，并明確規定限量。本文綜述了乳制品中β-內酰胺酶的常規檢測方法，并介紹了幾種新型檢測方法。

一、微生物法

微生物法采用對青霉素類藥物絕對敏感的標準菌株，利用舒巴坦特異性抑制β-內酰胺酶的活性，并加入青霉素作為對照，通過比對加入β-內酰胺酶抑制劑與未加入抑制劑的樣品所產生的抑制圈的大小來間接測定樣品是否含有β-內酰胺酶類藥物。崔生輝等運用此原理建立了該酶的檢測方法，該方法在牛奶中的檢出限為4U/毫升（U為酶的活力單位）。

該方法準確靈敏、應用廣泛，但檢測時間長、操作復雜、檢出限低，僅適用于對舒巴坦敏感的活性β-內酰胺酶的定性檢測，不適用于快速檢測。侯東軍等通過研究影響檢測方法的多種因素如原料乳的保藏溫度、保藏時間等對試驗進行了優化，提高了該檢測方法的準確性和可靠性。

二、碘量法

碘量法是根據青霉素或頭孢菌素經β-內酰胺酶作用而產生的裂解酸與碘結合，與淀粉競爭游離碘，從而使藍色的碘淀粉復合物褪色的原理而進行檢測的。此法為《中國藥典》中規定的檢測β-內酰胺酶活性的方法。謝巖黎等采用碘量法對牛奶中的β-內酰胺酶定性、定量分析，間接判斷牛奶中是否有β-內酰胺酶殘留。結果表明，當酶濃度大于30U/毫升時，可以用直接碘量法對其進行定性分析，用間接滴定法對其進行定量分析。

該法方便快捷、試劑易得、容易操作、再現性好，適于基層檢測單位和現場初篩，但該方法對反應時間等條件要求較嚴格，影響因素多，每次試驗均需要設置陽性和陰性對照，存在靈敏度差，檢出限高等缺點。

三、酸度法

酸度法是根據青霉素經β-內酰胺酶作用產生裂解酸引起pH變化，使指示劑變色或碳酸鈉溶液釋放出二氧化碳的壓力變化及以堿滴定來設計的。馬潔等利用雙酸度計法檢測了牛奶中β-內酰胺酶的殘留量。該方法在磷酸緩沖溶液（PBS）和牛奶中，對β-內酰胺酶的檢出限分別為10U/毫升和15U/毫升。

該法具有設備簡單、操作方便、檢測時間短等優點，適用于大多數實驗室，但不能用于酶動力學分析，且無法區分內源性與外源性β-內酰胺酶。

四、色譜法

高效液相色譜法是目前被廣泛應用的一種理化檢測方法，分直接法和間接法。

1.直接法。直接法是利用牛乳中的青霉素鉀或鈉在β-內酰胺酶的作用下或堿性條件下，分解成青霉噻唑酸鉀或毒霉噻唑酸鈉，經高效液相色譜儀檢測青霉噻唑酸鉀或毒霉噻唑酸鈉是否存在，從而判定牛奶中是否存在β-內酰胺酶。趙靜枚等利用高效液相直接法對青霉噻唑酸進行了定性檢測，結果表明實驗方法簡便快速，結果準確。

2.間接法。間接法是利用β-內酰胺酶能酶解青霉素的原理，在牛奶中添加一定量的青霉素，如果牛奶中存在一定濃度的β-內酰胺酶，那么青霉素經β-內酰胺酶酶解后濃度會下降，通過測定青霉素的濃度從而判斷牛奶中是否存在β-內酰胺酶。孫漢文等利用高效液相間接法建立了原乳中活性β-內酰胺酶的液相色譜-串聯質譜檢測方法，檢出限4U/毫升，加標回收率92.3%～95.5%。

該法靈敏度高、結果準確、操作時間短，但檢測成本較高，樣品前處理較煩瑣，檢測程序復雜，費用較高，適用于精確測定，可以作為開展仲裁檢驗的依據。

五、其他檢測方法

隨著生物化學技術的不斷進步，β-內酰胺酶的檢測技術不斷發展，近年來出現了幾種新型的檢測方法，相較于以往的檢測方法，操作更加簡便、結果更準確、靈敏度更高。

1.免疫法。免疫分析法的基本原理是以抗原或半抗原和抗體特異性結合為抗原－抗體復合物的免疫反應為基礎的生化測試技術。免疫分析法主要有放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析和酶聯免疫吸附法。

姜侃等應用氨芐青霉素抗體，人工制備氨芐青霉素和辣根過氧化物酶的結合物Amp-HRP，建立氨芐青霉素酶聯免疫檢測方法。應用該方法分別檢測樣品反應管和陰性對照管中氨芐青霉素，通過比較兩者OD450值，間接判斷樣品中是否含有β-內酰胺酶。結果成功建立了酶聯免疫間接快速測定鮮乳中β-內酰胺酶的方法，檢測靈敏度可達0.0005U/毫升。結論該方法檢測結果準確可靠，可廣泛應用于鮮乳中β-內酰胺酶的檢測。

張立靜等研制出快速、簡便、靈敏的免疫膠體金試紙條對牛奶中的β-內酰胺酶進行檢測，制備該酶的單克隆和多克隆抗體，并研制出膠體金標記的抗體，組裝并優化免疫膠體金試紙條，結果表明確定試紙條對牛奶中TEM1的檢測限8U/毫升，雖然該試紙條的最低檢測限比文獻報道的微生物法的檢測限偏高，但試紙條簡單、快速。

2.生物傳感器法。生物傳感器技術是利用生物化學和電化學原理，將生化反應信號轉換為電信號，放大和模數轉換，測量出被測物質及其濃度。生物傳感器按照所基于的特異性生物化學反應的不同，分為酶傳感器和免疫生物傳感器。酶傳感器依賴于酶催化反應的專一性，通過檢測反應的產物或/和底物，得到抗生素的含量。

周爽等建立了酶熱生物傳感器法，用于快速檢測酸奶中β-內酰胺酶。在酸奶中添加一定量青霉素G，使樣品中β-內酰胺酶充分酶解加入的青霉素G底物，然后直接通過酶熱生物傳感器進行分析。酶熱生物傳感器中裝備有專一性酶柱，能夠特異性地與青霉素G進行反應，并對其含量進行測定。根據震蕩反應前后酸奶樣品中青霉素G含量的變化，可以推算出酸奶樣品中β-內酰胺酶的活性。結果表明該方法樣品檢出限為2U/毫升，定量限為4U/毫升。與傳統微生物法相比，該方法操作簡單、儀器可便攜，顯著節約了檢測時間和成本，是傳統方法的有力補充，更適合于大規模樣品篩查和現場檢測。

六、小結

抗生素分解酶的出現及其在乳品中的非法添加而出現的假冒“無抗奶”是新出現的情況，而中國抗生素殘留檢測中尚無針對該情況的檢測標準方法。因此，進一步改進牛奶中抗生素殘留的檢測方法，增加抗生素分解酶的檢測，逐步完善中國標準檢測方法，對食品安全和奶牛疾病防控等均具有重要意義。