人參皂苷糖苷水解酶高產菌株CGMCC No.4316發酵工藝*

孫曉雨，呂國忠，謝明杰，趙志慧，孫曉東，蘇丹

1(遼寧師范大學生命科學學院，遼寧大連，116029)2(大連民族學院環境與資源學院，遼寧大連，116600)

人參皂苷為人參及其制品的主要活性成分，因其分子結構中糖基側鏈的不同而顯示不同的藥理特性和藥物活性［1］，將人參皂苷有效成分開發成臨床藥物及保健品已成當今醫藥市場的一大熱點，然而由于天然產物大多含量低、可吸收性差、價格昂貴，過度開發及濫用對自然資源和人文環境造成無法挽救的破壞和損失。因此，利用藥材本身的次生代謝產物開展有效成分高產率人參皂苷定向轉化技術研究具有極大的優勢和潛力。如何將含量較高的人參皂苷轉化成含量極低的人參皂苷，即將醫藥價值低的皂苷轉化為稀有皂苷，是人參皂苷轉化研究的熱門課題［2］。例如將人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Re等轉化成人參皂苷Rd、F1、Rh1、Rh2、compound Y、compound K 等。人參皂苷 Rd能促進 T細胞增殖，提高天然殺傷細胞(NK)的活性［3］;人參皂苷 Rh2具有明顯的抑腫瘤作用［4］。針對活性較低的人參皂苷的糖基，進行有目的的修飾和水解，是生產高活性人參皂苷的有效方法［5］。目前，相關領域多采用傳統化學法［6］、微生物發酵法、酶法［7］等分離制備人參皂苷。其中，化學方法存在選擇性低、提取效率低、環境危害大等諸多缺陷，化學合成至今尚未成功。相比之下，微生物方法具有資源豐富、反應條件溫和、底物特異性強等優勢成為制備稀有皂苷的最佳途徑。從人參根內分離獲得的專利菌株CGMCC No．4316(灰綠梨頭霉Absidia glauca)具有將人參皂苷Rb1專一轉化成稀有人參皂苷Rd的活性，轉化過程徹底且無其他副產物生成。本文對其產人參皂苷β-葡萄糖苷酶的培養基組分配比和培養條件進行了研究，探索合適的工業生產條件，以期為實現人參皂苷Rd的規模化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種灰綠犁頭霉Absidia glauca CGMCC No．4316系本實驗室分離、篩選和保存的專利菌株;人參皂苷單體化合物標準品Rb1、Rd購自吉林大學基礎醫學院;薄層層析板Silica Gel-60F254為德國MERCK公司產品;人參皂苷粉由遼寧本溪恒仁陽光保健品有限公司提供;其他試劑均為分析純。

1.2 培養基

斜面培養基:PDA培養基。

種子發酵培養基(g/L):葡萄糖 2．0，MgSO4·7H2O 0．5，CaCl21，黃豆餅粉10。

液體產酶培養基(g/L):麩皮20，蛋白胨1．0，KH2PO41．0，自然 pH，121 ℃滅菌 30 min。

1.3 實驗方法

1．3．1 發酵方法

將冰箱4℃下保藏的菌株 CGMCC No．4316經PDA斜面培養活化后，接入種子發酵培養液，在轉速(200 ±5)r/min、(30 ±0．5)℃下恒溫搖瓶培養18 h。然后轉入液體發酵培養基，250 mL搖瓶中加入45 mL液體培養基，接種量為3%(菌懸液中孢子含量為106個孢子/mL)，于30℃、160 r/min培養72 h，加入2%(m/v)人參根皂苷粉(人參皂苷含量75%)，繼續轉化36 h，發酵結束。上述發酵條件設置3個重復，結果取平均值。

1．3．2 酶液和生物量的制備

待上述發酵液在8 000 r/min下離心10 min，收集上清液，即為粗酶液。取沉淀收集菌絲體，經真空抽提后于100℃電熱恒溫烘至恒重后稱量菌絲體干重，確定生物量［8］。

1．3．3 酶活力的測定

取1 mg/mol(以0．02 mol/L，pH 5．0，HAc-cNaAc緩沖液配制而成)人參皂苷Rb1底物與酶液各0．1 mL于1 mL EP管中，40℃下反應24 h后加入0．2 mL水飽和正丁醇萃取溶劑，取上層10 μL作薄層色譜分析(TLC)。展開劑為氯仿∶甲醇∶水(70∶30∶5)，展開約6 cm，揮干溶劑，噴灑10%硫酸-乙醇加熱顯色，根據斑點顏色深淺確定酶反應進度，利用Band-scan工具軟件，對TLC圖譜進行產物含量分析并計算酶活力。

酶活力定義:一定溫度下，人參皂苷Rb1底物等體積反應24 h后，每小時轉化生成0．1 mg人參皂苷Rd所需的酶量，定義為1個酶活力單位。

1．3．4 單因素試驗設計

保持培養基其他組分不變，分別改變其中的碳源、氮源、金屬離子、pH、發酵溫度、發酵時間、瓶裝量、搖瓶轉數、底物投料量等培養條件，經過72 h搖床培養后測定相應酶活力和生物量，篩選出影響人參皂苷水解酶活力的關鍵因素。

1．3．5 響應面設計

采用Design Expert軟件設計試驗，運用BBD中心組合實驗設計原理，依據多項模擬方程擬合試驗對影響CGMCC No．4316產β-葡萄糖苷酶的關鍵因素作進一步研究，分析優化發酵最佳產酶條件。

2 結果與分析

2.1 培養基組分配比優化

2．1．1 不同碳源對產酶量的影響

以原始產酶培養基為基礎，分別以3．0%葡萄糖、果糖、蔗糖，麥麩皮和淀粉作為碳源，按照1．3．1發酵方法進行培養，相同濃度下測定酶活，確定最佳碳源。結果顯示，麥麩皮相對于其他碳源轉化效果好(見圖1)。

2．1．2 不同氮源對產酶量的影響

以原始產酶培養基為基礎，分別以 3．0%NaNO3、(NH4)2SO4、蛋白胨、花生粉、酵母粉、豆粕粉作為氮源，相同濃度下測定酶活，確定最佳氮源。由圖2可知，豆粕粉明顯優于其他碳源，底物轉化徹底，酶活力最高，達到90．4 U/mL。

圖1 碳源對產酶量的影響Fig．1 Effect of carbon source on enzyme production

圖2 氮源對產酶量的影響Fig．2 Effect of nitrogen source on enzyme production

2．1．3 金屬離子對產酶量的影響

在液體發酵產酶培養基中，分別以 K+、Mn+、Zn2+、Fe3+、Mg2+、Hg+、Cu2+、Ag+、Ca2+形式加入，加入量均為0．1%。以不加金屬離子為空白對照，按照上述發酵方法測定酶活。結果顯示，Cu2+對該菌產酶有明顯的抑制作用，Ca2+則可以一定程度激活該菌生長和代謝，從而提高產酶能力，其他金屬離子對產酶結果無明顯影響。

2.2 培養條件優化

2．2．1 pH 對產酶量的影響

分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調節酸堿度，測定不同初始 pH(3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0)對β-葡萄糖苷酶酶活力的影響，試驗結果(圖3)表明，初始pH 3．0時產酶量和生物量均處于最低水平，pH 5．0，酶活力最高，達到85 U/mL以上，菌絲體產量則達到最大值11．867 mg/mL。

2．2．2 發酵時間對產酶量的影響

圖3 pH對產酶量和生物量的影響Fig．3 Effect of pH on enzyme production and biomass

按照上述培養基配比及培養條件，測定不同轉化時間(24、48、72、84、96、120 及130 h)產酶情況，試驗結果(圖4)表明，隨著時間推移，產酶量和生物量均呈現先升后降的趨勢，在72 h兩者數值均達到高峰，繼續培養，增加幅度緩慢，隨之產量下降，確定72 h為發酵產酶的最佳時間。

圖4 發酵時間對產酶量和生物量的影響Fig．4 Effect offermentation time on enzyme production and biomass

2．2．3 發酵溫度對產酶量的影響

按照上述培養基配比及培養條件，考察不同發酵溫度(25、30、35、40、45 ℃)對底物的轉化情況。試驗結果表明，在25～35℃隨溫度增加，其產酶量增加，生長代謝加速，但超過40℃，菌體出現衰老自溶現象，酶逐漸失活。因此，確定最佳發酵溫度為30℃。

2．2．4 瓶裝量對產酶量的影響

250 mL 三角瓶中分別裝入25、45、65、85、105 mL上述培養基成分，測定酶活力以確定最佳裝瓶體積。試驗結果(圖5)表明，搖瓶的通氣效果和裝瓶體積呈反比，菌絲體產量隨著裝瓶量的增加而增加，但達到45 mL后，增加幅度不顯著，但以45～65 mL瓶裝量時產酶量較高。因此，最適瓶裝量為45 mL/250 mL搖瓶。

2．2．5 搖瓶轉數對產酶量的影響

按照上述篩選獲得的最佳發酵條件，將培養基分裝置于 100、140、160、180、200、220 r/min 下均轉72 h，考察通氣量對產酶量的影響(圖6)。試驗結果表明，轉數低于160 r/min菌體長勢緩滯;轉數高于200 r/min，菌絲體由于剪切增值，致使產酶量大幅度降低，因此，選擇最終轉數為180 r/min。

圖5 瓶裝量對產酶量和生物量的影響Fig．5 Effect ofmedium volume on enzyme production and biomass

圖6 搖瓶轉數對產酶量的影響圖Fig．6Effect of shaking speed on enzyme production

2．2．6 底物投料量對產酶量的影響

在以上最佳培養基配比和培養條件的基礎上，加入底物人參根皂苷粉1%、2%、3%、4%、5%、6%，考察不同投料量對轉化產酶量的影響。試驗結果表明，底物人參根皂苷粉末濃度10～20 mg/mL時，酶活力達84 U/mL以上，但隨著底物量增加，產酶量有所降低(圖7)。

圖7 底物投料量對產酶量的影響Fig．7 Effect of substrate concentration on enzyme production

2.3 響應面設計優化工藝

2．3．1 二次回歸擬合及方差分析［9］

根據上述單因子試驗結果，以培養基中對產β-葡萄糖苷酶活力影響較大的麥麩皮、蛋白胨和投料量3個因素為自變量，酶活力為響應值，設計3因素3水平的響應面分析試驗。因素水平選取及編碼見表1，試驗設計方案及結果見表2。

表1 因素水平設計與編碼Table 1 factor level design and coding

表2 試驗設計方案及結果Table 2 design scheme and test results

2．3．2 響應面試驗結果分析

運用 D esign Expert 8．0軟件對上述試驗數據進行二次多項回歸擬合，選擇對響應值有顯著影響的各項建立二次多元回歸方程:Y=91．85+1．14A+0．19B+0．57C-1．23AB+0．16AC-1．47BC-7．73A2-5．48B2+0．23C2。

經方差顯著性檢驗分析可知，該模型回歸極顯著(F=11．59，P=0．002 0)，此方程校正總決定系數 R2=0．937 1，R2Adj=0．8563，說明各部分試驗自變量與響應值之間線性關系顯著，因此，該模型預測性與擬合性良好，可以作為CGMCC No．4316產β-葡萄糖苷酶試驗的理論推測。由F值判斷因子的有效率為麥麩皮(A)＞投料量(C)＞蛋白胨(B)。其中麥麩皮和蛋白胨的相互作用影響極差明顯，優化結果見響應面曲線圖(圖8)和等高線圖(圖9)。通過響應面設計的最優組合為:麥麩皮 20．47 g/L、蛋白胨 9．74 g/L、投料量10%，酶活力可達92．793 U/mL。在響應面優化實驗值下進行3次平行試驗，驗證結果顯示，預測值與實際值幾乎吻合。因此，該模型能夠理想地預測CGMCC No．4316菌株的發酵產酶情況。

圖8 各因素交叉作用對產酶量影響響應面曲線圖Fig．8 Response surface plots showing the cross effects of factors on enzyme production

圖9 各因素交叉作用對產酶量影響等高線圖Fig．9 Line chart on highershowing the cross effects of factors on enzyme production

3 討論

人參皂苷Rd是二醇型人參皂苷Rb1在人體腸道內的主要代謝產物之一，具有廣泛的生物活性和生理作用。Rd的天然產量低，需從人參、三七、西洋參等藥用植物的根、莖、葉中提取以滿足醫療和科研的需要。該單體化合物的化學結構復雜，采用傳統加熱法、酸堿水解法可以使主要人參皂苷糖苷配基水解生成Rd［10］，但因其反應條件劇烈，水解過程易發生脫水、差向異構、羥基化等副作用，目標產物很難形成。迄今為止，生物轉化方法顯示出立體選擇區域較強、副產物單一等優勢，這就使得生物轉化制備稀有人參皂苷備受青睞。

近期的研究表明，能夠水解人參皂苷的酶多數來自于細菌(如 Caulobacter leidyia［11］)、霉菌(如 Absidia［12］)、植物(如 Panax ginseng［13］)。不同來源的真菌具有相似的酶解途徑和水解特性［14］，但各菌產酶能力及酶蛋白活性卻各不相同，Son等［15］利用Thermus caldophilus可產生將主要人參皂苷Rb1轉化成Rd的中間產物β-葡萄糖苷酶，但由于其抑制作用，反應時間延長30倍;Karikura等［16］研究表明腸道酶能將Rb1代謝為Rd，但在胃酸作用下Rb1不能徹底轉化;Fu［17］從西洋參中分離出的大型藥食兼用菌作為發酵菌株，為制備稀有人參皂苷Rd、Rb2、compound K提供參考，但由于其轉化過程中轉化產物不專一，底物對酶具有抑制作用。本文利用的灰綠犁頭霉是從人參根內分離獲得接合菌，在長期穩定的共生環境中可產生某種激素成分，促進人參生產或者增加人參的抗病能力。此外，由于該菌擁有轉化底物及產物的專一性，有望應用于發酵罐進行大規模工廠化生產醫療保健領域的Rd單體制備。

本研究利用人參根內分離鑒定的CGMCC No．4316菌株對Rb1進行發酵產酶條件研究，通過TLC薄層圖譜對照，計算機輔助優化分析模型，單因素設計試驗進行發酵條件優化，初步選出對人參皂苷糖苷酶活力有較大影響的關鍵因素作響應面分析［18］，在此基礎上綜合測定麥麩皮、蛋白胨及投料量對產酶量的進一步影響。借助Design Expert 8．0軟件建立相關因素的數學模型，進而利用響應面回歸分析獲得二次多項式擬合方程［19］，由校正系數及極差比較得出最優因子成分配比，獲得了 CGMCC No．4316菌株轉化Rb1生成Rd的最佳發酵工藝條件。研究結果表明，以麥麩皮20．47 g/L為碳源，蛋白胨9．74 g/L 為氮源，初始 pH 6．0，瓶裝量 45 mL/250 mL，搖瓶轉數180 r/min，投料量10%，30℃發酵72 h，其酶活力達到 92．78 U/mL。周偉［20］研究發現產酶培養基的組成和配比對天然藥物產量的提高以及產物單一性具有決定性作用。本研究從碳、氮搭配合適，pH、溫度調配恰當，轉數和裝瓶量適宜，原料經濟合理幾個方面著手，通過多種途徑及不同原料配伍試驗，可以在最短時間內迅速形成大量菌體，大幅度提高人參皂苷糖苷酶的活力，從而為獲得大量、高純度的人參皂苷Rd起到了一定的指導作用。此外，對于該內生菌產生的酶活性、酶性質以酶催化作用等問題，還有待深入探討和研究。

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