脂肪酶抑制劑Lipstatin的發酵罐發酵工藝優化

孫菲

(福建省微生物研究所，福建福州，350007)

胰脂肪酶抑制劑Lipstatin由毒三素鏈霉菌(Streptomyces tocytricini)代謝產生，它通過選擇性地抑制胃腸道內的胰脂肪酶減少30%的脂肪的分解和吸收，從而達到減重的目的，是目前唯一通過非中樞神經系統作用治療肥胖癥的藥物［1-2］，其作用機制獨特，安全性高。Lipstatin的四氫衍生物Orlistat(奧利司他)已被羅氏公司成功開發為減肥藥Xenical(賽尼可)。由于近年來減肥藥安全問題頻發，導致了一系列減肥藥物退出市場［3～6］。繼2010年 Sibutramine下架后，Oristat是目前市場上唯一的OTC減肥藥，占據了減肥藥市場80%的市場份額［7］。作為Oristat合成的關鍵中間體，生物合成Lipstatin的發酵備受關注。目前國內對Lipstatin發酵的研究多見于搖瓶水平的研究［8～12］，發酵罐工藝方面的報道較少。

本研究前期對Lipstatin搖瓶發酵條件進行了一系列的優化并取得了較好的結果［13］，但是搖瓶發酵條件和工業化發酵罐生產之間存在著差異，通常不是簡單的放大。從搖瓶到發酵罐的過渡，在放大過程中往往出現隨著發酵規模的擴大，目標產物的產量不斷下降的放大效應［14］。目前國內能進行Lipstatin發酵生產的企業僅有兩家［15］，這與其在放大過程中出現的技術難點有關。本研究在前期搖瓶工作的基礎上，利用10 L全自動發酵罐進行攪拌工藝、通氣量及補料工藝的優化，為Lipstatin的工業化生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

Streptomyces tocytricini FIM-1015，由福建省微生物研究所保藏。

1.2 培養基及搖瓶培養方法

1.2.1 斜面瓊脂培養基及培養方法

可溶性淀粉1%，蛋白胨 0.8%，NaCl 2.0%，Mg-SO40.03%，K2HPO40.02%，瓊脂 1.8%，pH 7.5，28 ℃培養7d。

1.2.2 種子培養基及培養方法

甘油2.5%，黃豆餅粉2.5%，酵母粉0.5%，葵花籽油 1.0%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%，瓊脂1.8% ，pH 7.0，裝量50 mL/500 mL，28 ℃培養30 h。

1.2.3 發酵培養基及培養方法

豆油5%、甘油 1.5%，黃豆粉 2%，玉米漿粉0.85%，卵磷脂1.5%，pH 7.0，裝量 50 mL/500 mL，搖床轉速280 r/min，28℃培養8d。

1.3 分批發酵培養方法

發酵罐為BGZ-7智能型機械攪拌發酵罐(上海保興生物設備)，體積10 L，搖瓶種子按1.2.2培養方法制備，接種量2.5%。發酵罐內培養基裝量7L，發酵溫度28℃，罐壓0.04 MPa，控制攪拌轉速及溶氧，實時監控各項參數。

1.4 測定方法

1.4.1 Lipstatin 發酵效價測定

試樣制備發酵液與無水乙醇1∶4稀釋搖勻浸泡1 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液用高效液相色譜法(HPLC)測定Lipstatin發酵效價。

HPLC色譜條件 色譜柱C18ODS(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測器DAD(HP1100)，柱溫40 ℃，檢測波長195 nm，流動相為乙腈∶水(85∶15)，流速1 mL/min。

1.4.2 pH 測定

采用酸度計測定。

1.4.3 菌體干重測定(DCW)

取10 mL發酵液，4 000 r/min離心10 min，菌體沉淀經2次蒸餾水洗滌后，用干燥定量濾紙過濾，105℃烘干至恒重，稱量菌絲體干重。

1.4.4 菌絲形態觀察［16］

菌絲經石炭酸美藍復合染色劑染色后以顯微鏡油鏡觀察。

2 結果與分析

2.1 溶氧對Lipstatin發酵的影響

搖瓶發酵過程中的溶氧是由空氣通過瓶口的介質擴散來提供氧氣的，通過調整搖瓶裝液量及搖瓶轉速控制搖瓶發酵中的溶氧水平考察溶氧對Lipstatin發酵的影響。表1為500 mL搖瓶中不同裝液量對Lipstatin發酵的影響，實驗結果表明搖瓶裝液量對Lipstatin發酵效價的影響較大，當裝液量高于50 mL/500 mL三角瓶時，其發酵效價顯著下降。表2為不同搖床轉速對Lipstatin發酵效價的影響，實驗結果顯示，當搖床轉速低于280 r/min時，Lipstatin發酵效價降低，當搖床轉速為200 r/min時，其相對效價僅為對照的53.1%。表1和表2的結果均表明Lipstatin發酵對溶氧的要求較高。

表1 搖瓶裝液量對Lipstatin發酵效價的影響Table 1 The effect of medium volume on Lipstatin productivity

表2 搖床轉速對Lipstatin發酵效價的影響Table 2 The effect of rotating speed of shaking bed on Lipstatin procuctivity

2.2 剪切力對Lipstatin發酵的影響

發酵罐采用機械攪拌方式增加溶氧水平，攪拌產生的剪切力對菌株發酵有一定的影響。在搖瓶中添加玻璃珠可以模擬發酵罐中機械攪拌對微生物發酵的影響。表3為添加直徑為5mm玻珠對Lipstatin發酵效價的影響，實驗結果表明添加玻璃珠個數對Lispstatin發酵效價影響較大，當添加4個玻璃珠時，其效價下降約40%，說明Lipstatin產生菌Streptomyces tocytricini FIM-1015對剪切力較為敏感，過強的剪切力易致菌絲體受到機械損傷，抑制菌體生長，不利于Lipstatin的生物合成。

表3 玻璃珠個數對Lipstatin發酵效價的影響Lable 3 The effect of glass beads number on Lisptatin productivity

2.3 Lipstatin 10 L發酵罐分批發酵工藝優化

從2.1的結果可知，Lipstatin的發酵對溶氧的要求較高，發酵罐分批發酵其溶氧水平與攪拌速度、通氣量及發酵液濃度等因素相關，因此Lipstatin發酵罐分批發酵將對以上工藝進行優化。

2.3.1 攪拌工藝對Lipstatin 10 L發酵罐分批發酵的影響

鑒于Lipstatin的發酵對溶氧的要求較高，同時對剪切力較為敏感，因此制定Lipstatin 10 L發酵罐分批發酵的攪拌工藝策略為發酵前期低轉速攪拌以保證菌絲體的生長，發酵中后期提高攪拌速度，改善溶氧，促進Lipstatin的生物合成。

2.3.1.1 起始攪拌速度的考察

按1.3的培養方法，設起始攪拌速度為150、200、250、300 r/min，通氣量為 10 L/min，24 h 取樣觀察菌絲形態，比較不同起始攪拌速度下的菌體量、溶氧水平及Lipstatin產生效價。實驗結果表明，當攪拌起始轉速為250、300 r/min時，由于攪拌產生的剪切力過大，菌絲體斷裂自溶(圖1-c、圖1-d)，不利于菌絲體生長，發酵周期內菌體量極低(圖2-a)，幾乎無效價產生。起始攪拌速度為150、200 r/min時，菌絲體生長健壯(圖1-a、圖1-b)，但起始攪拌速度為200 r/min時，發酵罐溶氧水平高于攪拌速度為150 r/min時，相應地，其菌體量及發酵效價也高于攪拌速度為150 r/min(圖2-a、圖2-b)。因此，選擇200 r/min作為Lipstatin發酵的起始攪拌速度。

2.3.1.2 攪拌終速度的考察

從2.3.1.1 的結果可知，0 ～24 h 為 Lipstatin 產生菌Streptomyces tocytricini FIM-1015的對數生長期，菌體生長24 h后菌體量增高(圖2-a)，對剪切力的耐受力增強，此時增加攪拌轉速對菌體生長的不利影響較小。同時0～24 h間耗氧量增大，罐內溶氧量急劇下降，使得Lipstatin的發酵效價遠低于搖瓶水平(圖2-b)。因此，選擇在發酵24 h后開始逐漸增加攪拌轉速。

由圖2-b可見，Lipstatin發酵效價自96 h開始大幅提高，因此，攪拌工藝選擇自24 h逐漸增加至96 h達到終速度。按1.3的培養方法，設攪拌終速度為400、450、500、550 r/min，比較不同攪拌終速度對 Lipstatin發酵過程中的溶氧及發酵效價的影響。

圖1 不同起始攪拌速度對菌絲形態的影響Fig.1 The effect of initiative mixing speed on mycelial morphology

圖2 不同起始攪拌速度對Lipstatin發酵的影響Fig.2 The effect of intiative mixing speed on Lipstatin productivity

圖3 不同攪拌終速度對Lipstatin發酵的影響Fig.3 The effect of ultimate mixing speed on Lipstatin producitivity

圖3結果表明，攪拌轉速對Lipstatin發酵的溶氧水平和效價有顯著影響。攪拌終轉速在400～550 r/min范圍內，隨著攪拌終轉速的增加，發酵罐溶氧水平及Lipstatin發酵效價隨之提高，但攪拌終轉速為500 r/min時其發酵效價與550 r/min時相差不大，因此最佳攪拌終轉速為500 r/min。通過優化攪拌工藝，使Lip-statin發酵效價達到4 300 μg/mL，與搖瓶發酵水平相當。發酵時間為168 h，比搖瓶發酵時間縮短1d。

2.3.2 通氣量對Lipstatin 10 L發酵罐分批發酵的影響

按1.3培養方法，采取2.3.1攪拌工藝進行Lipstatin 10 L發酵罐分批發酵，設通氣量分別為8、10、12、15 L/min，比較不同通氣量下的溶氧及Lipstatin發酵效價，以確定最佳通氣量。

實驗結果表明(圖4)，通氣量對溶氧及Lipstatin發酵效價的影響較小。可能原因為Lipstatin發酵培養基為特殊的高油培養基，高濃度豆油與乳化劑卵磷脂作用使得培養基呈現較高的黏稠度，即使增大通氣量，也不利于氧在培養基介質中的擴散。

圖4 不同通氣量對Lipstatin發酵的影響Fig.4 The effect of ventilatory capacity on Lipstatin producitivity

2.3.3 補料工藝對Lipstatin 10 L發酵罐分批發酵的影響

攪拌工藝的優化能顯著提高24～96h間發酵罐的溶氧水平，但96 h后溶氧水平急劇下降，實驗中觀察發現發酵液逐漸變黏稠，即使提高轉速也不能有效增加溶氧(圖3-a)。這可能是由于Lipstatin發酵培養基為高油培養基，質地黏稠，發酵過程中菌絲的生長和產物的合成進一步增強發酵液的粘稠度，同時Lipstatin發酵過程中通氣量大，攪拌速度快，水分易蒸發，使發酵液黏稠度進一步增高等原因導致的。采取補料工藝是改善溶氧、提高Lipstatin發酵水平的有效方法。降低基礎配料中豆油的含量(從5%到3%)，分別在發酵 72、96、120h 時補加 1.5%豆油，補料量是發酵液體積的0.5%。

圖5 補料工藝對Lipstatin發酵的影響Fig.5 The effect of fed bacth fermentation on Lipstatin productivity

由圖5-a可見，分批發酵72 h后pH持續上升，192 h pH達到8.0，這可能是因為發酵時菌體利用速效氮源產生游離NH4+引起的。分批發酵96 h后溶氧水平急劇降低，Lipstatin效價增長速度在144 h后趨緩。圖5-b顯示補料發酵72 h后pH緩慢下降，192 h pH為6.3，這可能是因為補料后油脂分解產生脂肪酸會中和OH-，所以發酵中后期pH較為穩定，補料發酵96h后溶氧水平保持在30%以上，溶氧水平較分批發酵顯著提高，補料發酵恒定的pH環境和較高的溶氧水平大大促進了Lipstatin的合成，發酵144 h后Lipstatin效價仍以較快速度增長，168 h發酵效價達到6 446μg/mL，比分批發酵產量提高50%。

3 討論

Lipstatin產生菌的生長及Lipstatin的生物合成對溶氧水平有較高的要求，而Lipstatin發酵培養基為特殊的高油培養基，培養基中豆油與乳化劑卵磷脂相互作用使培養基呈現較高的黏稠度，發酵過程中菌絲的生長和水分的蒸發則進一步增高發酵液的黏稠度，不利于氧在發酵液中的擴散，增大通氣量不能有效提高發酵過程中的溶氧水平。

本研究根據Lipstatin發酵特點優化攪拌工藝、建立補料工藝以改善Lipstatin發酵過程中的溶氧水平。由于Lipstatin產生菌對剪切力敏感，研究建立了前期200 r/min低轉速攪拌，發酵中后期提高攪拌速度，最終攪拌速度為500 r/min的工藝。發酵96 h后由于菌絲生長、水分蒸發，發酵液黏稠度高，溶氧水平急劇下降，此時提高攪拌速度不能有效改善溶氧。通過建立補料工藝，降低基礎配料中豆油比例，于發酵中后期不同時間補入1.5%的豆油，既降低發酵培養基的黏稠度，發酵前期溶氧顯著提高，又避免發酵中后期菌絲大量生長、耗氧過多而供養不足，使發酵溶氧水平保持在30%以上。抗生素等次級代謝產物的發酵分為菌體生長期和產物合成期2個階段，一般在菌體生長的對數末期添加前體物質有利于次級代謝物的合成，補料工藝的建立也在Lipstatin合成階段為其提供前體物質(豆油)。通過以上工藝的優化，Lipstatin 10 L發酵罐發酵效價達到6 446μg/mL，較搖瓶發酵效價提高約40%，發酵周期縮短1d。本研究結果為Lipstatin的工業化規模發酵奠定了基礎。

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