椰子種皮油提取物對氧化損傷的保護作用*

張玉鋒，段岢君，趙曉莉，陳衛軍，趙松林

1(中國熱帶農業科學院椰子研究所，海南文昌，571339)

2(海南大學食品學院，海南海口，570228)

3(國家重要熱帶作物工程技術研究中心，海南海口，571101)

椰子(Cocosnucifera L.)為棕櫚科椰子屬多年生常綠喬木，是熱帶地區的一種重要水果和油料作物，除了用于生產食品外，還可作為椰殼活性炭、椰衣纖維、汽車坐墊等工業產品的原料，應用范圍廣泛，被稱為“生命之樹”［1］。據報道，干燥后的成熟椰肉中脂肪含量高達70%，以其為原料生產的椰子油富含中短鏈飽和脂肪酸，具有殺菌、抗病毒、抗癌和減少心血管疾病發生危險等多種功效［2］。因此，椰子油等相關產品的消費量日益增加，這也意味著椰子種皮等副產物的大量產生，對這些副產物的加工利用已成為椰子加工業的重要課題，其高值化利用具有明顯的經濟和社會效益。

椰子種皮是成熟椰肉上附著的一層黑褐色薄皮，每個椰果可得種皮約100 g。在椰肉榨油時，如果附有種皮，會對所得油脂的色澤和性質產生負面影響，不利于市場銷售，所以在榨油前將種皮削除。據統計，海南省每年可產椰子種皮2.37萬t，而這些種皮多被直接丟棄，或作為培養基質和動物飼料使用，附加值和利用率均較低［3］。因此，本文以椰子種皮為原料，提取種皮油，制備提取物，并探討該提取物對氧化損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 椰子種皮油(coconutendocarp oil，CEO)的制備［4］

成熟的椰子，從中間剖開，取出椰肉，將附著于椰肉上的一層棕色椰子種皮削下收集，50℃烘干，粉碎，得種皮粉末。取粉末50 g，加入200 mL異丙醇，60℃超聲波輔助提取3h，真空抽濾，收集濾液;再向濾渣中加入200 mL異丙醇，重復提取3次，合并濾液，45℃旋蒸，除去溶劑，得椰子種皮油。4℃保存備用。

1.2 椰子種皮油提取物(coconut endocarp oil extract，CEOE)的制備

參考Seneviratne等［5］的方法，取椰子種皮油50 g，按照5∶1(mL∶g)的料液比，加入10 mL 體積分數80%的甲醇，超聲波輔助提取10 min，然后于2 000 r/min離心30 min，收集上層清液，再加入10 mL體積分數80%的甲醇，如此反復提取3次，合并上清液，于40℃旋轉蒸發除去甲醇，而后冷凍干燥除去水分，得到椰子種皮油提取物。將提取物貯存于4℃冰箱中，用時取出用80%的甲醇溶解，并配制成一定濃度的溶液。

1.3 CEOE對人血清蛋白氧化損傷的保護作用

1.3.1 人血清蛋白(human serum albumin，HSA)的氧化處理［6］

10 mg/mL的人血清蛋白中分別加入等量的提取物甲醇溶液，Trolox，超純水，混勻，然后分別加入10 mmol的 H2O2，在37℃水浴中反應 2 h。樣品與Trolox 的濃度梯度均為 0.5、1.0、1.5、2.0 和 2.5 mg/mL。

1.3.2 對蛋白質羰基形成的抑制作用

參考Levine等人［7］的方法，并稍作修改:分別取上述混合液400 μL，加入400 μL濃度為 10 mmol/L的 2，4-二硝基苯肼(2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH)，空白以2 mol/L HCl代替，混勻，室溫下于暗處反應1 h，每隔10 min漩渦1次。然后加入400 μL TCA(20%)蛋白質腙衍生物。于4℃、16 000 r/min、離心5 min，棄去上清液。沉淀用1 mL乙醇/乙酸乙酯(體積比為1∶1)洗滌3次，每次洗完于16 000 r/min、4℃離心5 min，棄去上清液。最后沉淀用1.25 mL濃度為6 mol/L的鹽酸胍溶解，離心取上清液于370 nm測吸光值。每個樣品做3個平行。

蛋白質羰基氧化抑制率/%=(1-A樣品/A空白)×100

1.3.3 蛋白質氫過氧化物含量的測定

本實驗采用二甲酚橙法［8］測定氫過氧化物含量。取0.1 mL氧化后的蛋白質溶液，分別加入1 mL硫酸亞鐵銨(0.5 mmol)，1 mL 二甲酚橙(0.2 mmol)，室溫下反應30 min，于560 nm處測試吸光值。

1.4 過氧化氫清除能力的測定［9］

1 mL的提取物/Trolox中依次加入1.0 mL的10 mmol/L H2O2，1.0 mL 硫酸亞鐵銨，0.3 mL 二甲酚橙，及1 mL 25 mmol/L的H2SO4，用PBS補充體積至5 mL，充分混勻，暗處反應30 min，于560 nm處測試吸光值。對照組以水代替樣品，樣品對照組不添加H2O2，每個樣品做3個平行。

過氧化氫清除率/%=［1-(A樣品-A對照)/A對照］×100

1.5 CECO對羥基自由基誘導的DNA氧化損傷的保護作用

羥基自由基誘導DNA損傷，DNA結構由超螺旋結構斷裂成環狀或者線性結構。參照Wei等［10］的方法，略加改動:準確稱取瓊脂糖0.25 g，放入錐形瓶中，加入25 mL的1×TAE緩沖液，加熱使瓊脂糖完全溶解，待冷卻至60℃，加入2 μL EB(溴化乙錠)染色液，混勻，倒入膠板鋪板。室溫下(約30 min后)待凝膠完全凝固，拔出梳齒，將膠板放入盛有1×TAE緩沖液的電泳槽中。終體積為25 μL的反應液中，分別含有 50 ng/μL 的 pBR 322 DNA 2 μL，5 mmol/L的 FeSO45 μL，3%的 H2O22 μL，100 mmol/L pH 7.4的PBS，濃度為0.1 mg/mL的提取物甲醇溶液1、2、3、4和5 μL，以同濃度同體積的Trolox作對照，以超純水代替樣品做空白。37℃水浴反應1h，加入5 μL上樣緩沖液，點入1%的瓊脂糖凝膠中，90V電泳30 min，凝膠成像系統拍照。

1.6 數據處理

所有數據均用平均值±SD表示;使用Origin 8.0和Excel制作圖表，并用SPSS 17.0進行方差分析和顯著性檢驗(P＜0.05)。

2 結果與討論

2.1 椰子種皮油提取物對人血清蛋白氧化的保護作用

2.1.1 提取物對蛋白質羰基氧化的抑制作用

機體內的蛋白質氧化會影響多種細胞功能，涉及受體、信號傳導機制、運輸系統和各種酶類，并可導致其他生物分子的二次損傷，如DNA修復酶失活等。有報道稱羰基生成是由活性氧攻擊氨基酸分子中自由氨基或亞氨基，經反應最終生成NH3和相應的羰基衍生物［11］，可見蛋白質羰基的產生是蛋白質分子被自由基氧化修飾的一個重要標記，因此可通過測定羰基的含量來判斷蛋白質被氧化損傷的情況。

圖1顯示的是不同濃度的提取物對蛋白質羰基氧化的抑制效果。可以看出，雖然CEOE的抑制效果均低于同濃度的Trolox，但是該提取物也表現出了抑制蛋白質羰基生成的潛能，且隨著CEOE濃度的增加，其抑制作用呈現逐漸增強的趨勢，即具有明顯的劑量效應。此外，濃度為 1.5、2.0 和 2.5 mg/mL 的CEOE 的抑制效果分別與 0.5、1.0 和 2.0 mg/mL 的Trolox的作用相當。這就說明在一定程度上，椰子種皮油提取物可以作為一種抗氧化添加組分來降低由H2O2誘導的蛋白質羰基增多的氧化損傷。

圖1 CEOE/Trolox對蛋白質羰基氧化的抑制作用Fig.1 Inhibiting effect of CEOE/Trolox on the oxidation of protein carbonyl

2.1.2 提取物對蛋白質氫過氧化物含量的影響

Gieseg等人［12］的研究表明，人工培養的U973細胞在暴露于H2O2的情況下會誘發蛋白質氫過氧化物的生成，并且該過氧化物會作為新的自由基源與細胞內的抗氧化劑發生反應，從而導致谷胱甘肽還原酶失活和DNA交聯等機體損傷。因此抑制蛋白質氫過氧化物的形成也是抗氧化劑發揮其抗氧化作用的一種途徑。如圖2所示，與空白組(濃度為0 mg/mL組)相比，添加了CEOE與Trolox實驗組的吸光值明顯降低，即CEOE與Trolox均可以有效降低蛋白質氫過氧化物的含量;并且隨著濃度的增加，吸光值越來越小，表明高濃度的CEOE及Trolox更能抑制蛋白質氫過氧化物的生成，從而降低氧化損傷。

圖2 CEOE/Trolox對蛋白質氫過氧化物含量的影響Fig.2 Impaction effect of CEOE/Trolox on protein hydroperoxides

2.2 提取物對過氧化氫的清除能力

圖3顯示的是CEOE和Trolox對過氧化氫的清除能力。

圖3 CEOE/Trolox對過氧化氫的清除能力Fig.3 Scavenging activity of CEOE/Trolox on hydrogen peroxide

可以看出，隨著濃度的增加CEOE對H2O2的清除能力逐漸增強，在濃度為2.5 mg/mL時，清除率達(49.81±3.10)%，且其清除能力與自身濃度呈現正相關(R2=0.974)。有研究表明，機體內的過氧化物和氫過氧化物一般是機體細胞組分與自由基或活性氧發生相互作用時的最初產物，當機體細胞處在過氧化氫中時，糖酵解反應中的ADP磷酸化過程會被抑制，從而造成機體供能不足［13］。因此，可將CEOE開發成一種抗氧化組分添加到食品中去，以清除機體內的過氧化氫，保證機體供能。

2.3 椰子種皮油提取物對DNA損傷的保護作用

在Fe2+的催化作用下，過氧化氫可產生羥基自由基，從而引發自由基鏈式反應。而超螺旋(SC)質粒DNA在Fenton反應體系中極易因氧化而使雙鏈斷裂形成開環(OC)或線性(L)結構。在同一濃度的瓊脂糖凝膠中，超螺旋DNA分子遷移率比線性DNA分子快，線性DNA分子比開環DNA分子快［14］。由圖4可以看出，未加提取物的反應組(Lane 2)在羥基自由基的作用下，DNA超螺旋結構發生了嚴重的解螺旋現象，雙鏈斷裂形成了開環和線性結構。而同Lane 2相比，加入100 ng CEOE的Lane 3的DNA超螺旋結構僅發生部分斷裂，形成少許開環結構，且未發現線性DNA。此外，隨著CEOE濃度的增加，該保護作用呈現逐漸增強的趨勢:當提取物添加量達到300ng(Lane 5)時，已不會出現解螺旋現象。這就說明該提取物可有效預防或者修復羥自由基誘導的DNA損傷。

圖4 CEOE/Trolox對羥基自由基誘導的DNA損傷的保護作用Fig.4 Protective effect of CEOE/Trolox on hydroxyl radical-induced DNA damage

3 展望

本研究結果表明，椰子種皮油提取物(CEOE)可有效抑制因自由基或活性氧引發的蛋白質羰基和氫過氧化物的增多，并具有一定的過氧化氫清除能力;同時該提取物還可以顯著預防和修復羥自由基誘導的DNA損傷;表現出了較好的抗氧化潛能，是一種值得開發的抗氧化劑資源。但是，提取物的主要成分以及其中發揮抗氧化作用的主要物質組成和其抗氧化機理還有待進一步研究。

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