火麻仁濃縮蛋白制備工藝研究及蛋白組成測(cè)定

王廣莉，周鴻翔，黃小煥，柳蔭，陳龍

（貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025）

火麻仁是?？浦参锎舐椋–annabis sativa L.）的干燥成熟種仁，是典型的藥食同源作物，在中國(guó)作為藥食同源已經(jīng)有3000多年的歷史[1]?；鹇槿实鞍踪|(zhì)主要含有麻仁球蛋白和麻仁白蛋白。其中65%為麻仁球蛋白，麻仁球蛋白能夠促進(jìn)消化，相對(duì)無(wú)磷，是細(xì)胞DNA骨架原料；另外35%為白蛋白。這兩種植物蛋白具備人體所有必需氨基酸，且屬于容易消化的全價(jià)蛋白質(zhì)，與其他植物蛋白質(zhì)相比含豐富的精氨酸和谷氨酸，同時(shí)，有含量比較高的胱氨酸、蛋氨酸和組氨酸。精氨酸和組氨酸對(duì)兒童生長(zhǎng)發(fā)育及中老年人預(yù)防心血管疾病有很重要的作用。含硫氨基酸、蛋氨酸和半胱氨酸都是合成酶所必需的氨基酸。經(jīng)臨床試驗(yàn)證明，除了火麻仁油的通便作用外，也能促進(jìn)通便，同時(shí)具有提高耐缺氧、改善貧血、降低膽固醇和降血壓等功效，是一種十分優(yōu)異的植物蛋白質(zhì)新來(lái)源?；鹇槿实鞍追酆袌?jiān)果香味，很受食用者歡迎，可加到焙烤食物、奶制品及飲料制品中，既可增加營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，又能起到保健、醫(yī)療等作用[2-3]。

本研究以火麻仁冷榨餅粕為原料，采用高速剪切法制備火麻仁蛋白，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，結(jié)合正交分析研究液料比、剪切速度和剪切時(shí)間對(duì)火麻仁蛋白質(zhì)提取率影響及它們之間的交互作用，從而確定高速剪切法制備火麻仁蛋白的最佳工藝。同時(shí)選用傳統(tǒng)的Osborne分級(jí)分離方法和高效液相色譜儀測(cè)定火麻仁濃縮蛋白中的氨基酸組成及含量，對(duì)火麻仁營(yíng)養(yǎng)成分獲得全面了解，為火麻仁蛋白在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

火麻仁冷榨餅粕：冷榨提取火麻仁油脂后所剩餅粕。

MB23/MB25快速水分測(cè)定儀：奧豪斯儀器（上海）有限公司；K9840凱氏自動(dòng)定氮儀：濟(jì)南海能儀器有限公司；HFJ-10內(nèi)切式勻漿機(jī)：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；B-290實(shí)驗(yàn)室小型噴霧干燥機(jī)：瑞士Buchi公司。

1.2 方法

1.2.1 火麻仁蛋白質(zhì)制備方法

火麻仁冷榨餅粕→去殘油→粉碎→組織勻漿→過濾→噴霧干燥→火麻仁蛋白粉

稱取一定量去殘油粉碎后餅粕，按一定液料比加入去離子水，調(diào)節(jié)不同的剪切速度剪切一定時(shí)間，使用濾布過濾剪切好的蛋白溶液去除不溶性纖維素等雜質(zhì)，棄濾渣，濾液進(jìn)行噴霧干燥，得火麻仁濃縮蛋白粉，稱量濃縮蛋白粉質(zhì)量，計(jì)算提取率，并取少量濃縮蛋白粉使用凱氏定氮法測(cè)其純度。

1.2.2 火麻仁蛋白質(zhì)提取率計(jì)算方法

1.2.3 火麻仁蛋白質(zhì)純度的計(jì)算方法

式中：X為粗蛋白質(zhì)的含量，%；V1為試樣消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；V0為空白消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，mL；c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，（mol/L）；V 為試樣分解液總體積，mL；V′為試樣分解液蒸餾用體積；m為試樣質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 去殘油后火麻仁餅粕基本組成分析

對(duì)去除殘油后的火麻仁餅粕進(jìn)行粗蛋白、粗脂肪、水分、灰分、還原糖、淀粉、粗纖維的測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 去殘油后火麻仁餅粕基本組成Table 1 The composition of cake removed oil

由表1可知，去除殘油后的火麻仁餅粕，其粗脂肪含量為2.60%，而其粗蛋白質(zhì)含量為68.66%，水分含量7.60%，灰分10.50%，還原糖1.33%，淀粉5.57%，粗纖維3.74%，為了提高蛋白質(zhì)的含量，可從去除粗纖維和淀粉及還原糖等碳水化合物以提高蛋白質(zhì)的含量。

2.2 液料比對(duì)火麻仁蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

剪切速度 15000 r/min，剪切時(shí)間8 min，以火麻仁蛋白質(zhì)提取率及純度為指標(biāo)，分別采用液料比（mL/g）為10 ∶1、15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果見圖1。

圖1 液料比比對(duì)火麻仁濃縮蛋白提取率及純度的影響Fig.1 Effect of Solid-liquid ratio on cannabi seed protein concentrate extraction rate and purity

由圖1可知，隨著液料比的增大火麻仁濃縮蛋白提取率及純度均逐漸增大，當(dāng)液料比為20∶1（mL/g）時(shí)火麻仁濃縮蛋白純度達(dá)到最大值84.42%，之后隨著液料比的增大純度呈下降趨勢(shì)，到液料比25∶1（mL/g）時(shí)純度降到80.00%。而提取率在20∶1（mL/g）至25∶1（mL/g）期間變化劇烈，在液料比 25 ∶1（mL/g）時(shí)達(dá)到最大值78.28%，考慮到液料比過大時(shí)，不但增加能耗，而且會(huì)因增加廢水量而加大環(huán)境的污染，最終選擇液料比 25 ∶1（mL/g）為最佳液料比。

2.3 剪切速度對(duì)火麻仁蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

在液料比25∶1（mL/g）、剪切時(shí)間10 min條件下，以火麻仁蛋白質(zhì)提取率及純度為指標(biāo)，分別采用剪切速度 5000、 10000、 15000、 20000、 25000r/min 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果見圖2。

圖2 剪切速度對(duì)火麻仁濃縮蛋白提取率及純度的影響Fig.2 Effect of Shear rate on cannabi seed protein concentrate extraction rate and purity

由圖2可知，隨著剪切速度的增大，火麻仁濃縮蛋白得率及純度均逐漸增大，當(dāng)剪切速度為 15000 r/min時(shí)達(dá)到最大值，之后隨著剪切速度的增大，反而呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)榻?jīng)過一定速率的剪切處理，火麻仁蛋白凝聚的蛋白質(zhì)分子逐漸解締并伸展，高速剪切作用使蛋白質(zhì)大分子聚集體破碎為蛋白質(zhì)分子[4]，同時(shí)增加了原先包埋在分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)的暴露機(jī)會(huì)。但剪切速率過大，使蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生不可逆的裂解，破壞程度加大，導(dǎo)致分子表現(xiàn)直徑減少[5]，由此選擇 15000 r/min為最佳剪切速度。

2.4 剪切時(shí)間對(duì)火麻仁蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

在液料比 25 ∶1（mL/g）、剪切時(shí)間 15000 r/min 條件下，以火麻仁蛋白質(zhì)提取率及純度為指標(biāo)，分別采用剪切時(shí)間 4、8、12、16、20 min 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著剪切時(shí)間的延長(zhǎng)，火麻仁濃縮蛋白得率及純度均呈上升趨勢(shì)，在4 min～12 min期間其上升效果明顯，12 min后趨于平緩，這是因?yàn)殡S剪切時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)空間構(gòu)象發(fā)生變化，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性物質(zhì)暴露出來(lái)，然而，剪切時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，部分蛋白質(zhì)的活性部位逐漸被破壞[4]，因而趨于平緩，綜上最終選擇12 min為最佳提取時(shí)間。

圖3 剪切時(shí)間對(duì)火麻仁濃縮蛋白提取率及純度的影響Fig.3 Effect of Shearing time on t cannabi seed protein concentrate extraction rate and purity

2.5 火麻仁蛋白質(zhì)提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，選取液料比、剪切速度、剪切時(shí)間三因素，選擇三水平，以提取率和純度為指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

表2 因素水平表L9（34）Table 2 Factors and levels of multiple factors experiments

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment design and statistics results

對(duì)提取率進(jìn)行極差分析，結(jié)果如表4所示，對(duì)提取率的較優(yōu)組合為A2B2C2。3種影響因素的極差值（R）液料比＞剪切速度＞剪切時(shí)間，表明高速剪切法制備火麻仁濃縮蛋白效果影響最大的是液料比，其次是剪切速度，剪切時(shí)間影響較小。方差分析結(jié)果（表5）表明液料比對(duì)火麻仁濃縮蛋白提取率影響顯著（P＜0.05，F(xiàn)比＞＞F臨界值），剪切速度對(duì)提取率影響達(dá)到顯著水平（P＜0.05，F(xiàn)比＞F臨界值），剪切時(shí)間（P＜0.05，F(xiàn)比＜F臨界值）影響不顯著。

表4 極差分析表（提取率）Table 4 Analysis of range of orthogonal experiments

表5 方差分析表（提取率）Table 5 Analysis of variance of orthogonal experiments with multi-enzymes

對(duì)純度進(jìn)行極差分析，結(jié)果如表6所示，對(duì)純度的較優(yōu)組合為A1B2C2。三種影響因素的極差值（R）液料比＞剪切速度＞剪切時(shí)間，表明高速剪切法制備火麻仁濃縮蛋白效果影響最大的是液料比，其次是剪切速度和剪切時(shí)間。方差分析結(jié)果（表7）表明液料比對(duì)火麻仁濃縮蛋白純度影響打顯著水平（P＜0.05，F(xiàn)比＞F臨界值），剪切速度和剪切時(shí)間對(duì)純度（P＜0.05，F(xiàn)比＜F臨界值）影響不顯著。

表6 極差分析表（純度）Table 6 Analysis of range of orthogonal experiments

表7 方差分析表（純度）Table 7 Analysis of variance of orthogonal experiments with multi-enzymes

選用綜合平衡法分析，由上表可知，對(duì)于提取率來(lái)說，極差最大的是液料比，其次是剪切速度，剪切時(shí)間最小，最佳組合為A2B2C2；對(duì)純度來(lái)說，液料比、剪切速度、剪切時(shí)間的極差相差不大，最優(yōu)水平組合為A1B2C2，而液料比對(duì)應(yīng)的提取率極差大于純度極差，所以最終平衡選擇A2，綜合上述分析，得較優(yōu)生產(chǎn)工藝條件為A2B2C2，與單因素結(jié)果吻合。

2.6 火麻仁蛋白質(zhì)各蛋白組分分布

選用傳統(tǒng)的Osborne分級(jí)分離方法，對(duì)火麻仁濃縮蛋白分級(jí)分離，分為水溶蛋白、鹽溶蛋白、堿溶蛋白、醇溶蛋白、泡沫蛋白，殘?jiān)惺Ｓ嗟牡鞍诪闅堅(jiān)鞍?，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定分離后蛋白溶液相對(duì)含量，結(jié)果如表8所示。

表8 火麻仁蛋白各蛋白組分的組成比例Table 8 The protein contentof cannabis protein

由測(cè)定結(jié)果可知火麻仁主要含鹽溶性蛋白和堿溶性蛋白，其中含量最高的是堿溶性蛋白38.38%，其次是鹽溶性蛋白31.52%，其總量占總蛋白的70%。而水溶性蛋白、醇溶性蛋白和泡沫蛋白含量均較低較低，分別為為8.83%、3.51%和3.47%，這也是火麻仁蛋白在水中的溶解性不好的原因。

2.7 火麻仁蛋白質(zhì)氨基酸組成

根據(jù)GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸的測(cè)定》，使用安捷倫1100型高效液相色譜儀測(cè)定火麻仁濃縮蛋白中的氨基酸組成及含量，測(cè)定圖譜如圖4所示。

圖4 火麻仁濃縮蛋白氨基酸組成圖譜Fig.4 The amino acid composition map of cannabis condensing protein

由表9可知，火麻仁濃縮蛋白質(zhì)有高含量的精氨酸和谷氨酸，同時(shí)，有含量比較高的苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、天門冬氨酸和組氨酸。精氨酸和組氨酸，它們對(duì)兒童生長(zhǎng)發(fā)育都有著重要的作用，精氨酸容易在血管產(chǎn)生NO，這對(duì)于中年人預(yù)防心血管疾病很有幫助。必需氨基酸含量十分豐富，其中纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、組氨酸的含量均高于FAO/WHO的小孩推薦值，亮氨酸和蘇氨酸的含量稍微低于FAO/WHO的小孩推薦值，而大大高于FAO/WHO的成人推薦值；與推薦的氨基酸模式相比，除了色氨酸、賴氨酸、胱氨酸稍微缺乏之外，火麻仁濃縮蛋白含有豐富的必需氨基酸。

表9 火麻仁濃縮蛋白質(zhì)氨基酸組成測(cè)定結(jié)果Table 9 The determination results of amino acid of cannabis condensing protein

3 結(jié)論

本研究對(duì)提油脫脂后的火麻仁餅粕采用高速勻漿機(jī)剪切，提高火麻仁蛋白在水溶液中的溶解性，通過建立液料比、剪切速度和剪切時(shí)間的單因素實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化制備工藝，獲得了高速剪切法制備火麻仁濃縮蛋白工藝條件為：液料比25∶1（mL/g），剪切速度 15000 r/min，剪切時(shí)間12 min，在此最佳工藝條件下所制備的火麻仁蛋白粉提取率為76.325%，純度達(dá)82.308%，達(dá)到濃縮蛋白的指標(biāo)（70%）。選用傳統(tǒng)的osborne分級(jí)分離方法和高效液相色譜儀測(cè)定火麻仁濃縮蛋白中的氨基酸組成及含量，測(cè)定結(jié)果為火麻仁主要含鹽溶性蛋白和堿溶性蛋白，其中含量最高的是堿溶蛋白38.38%，其次是鹽溶蛋白31.52%，其總量占總蛋白的70%。而水溶性蛋白、醇溶性蛋白和泡沫蛋白含量均較低，分別為為8.83%、3.51%和3.47%。

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