張 鵬,李 慧,王秋紅,陳澄宇,慕 衛,劉 峰
(山東農業大學,農藥毒理與應用技術省級重點實驗室,泰安 271018)
韭菜遲眼蕈蚊Bradysia odoriphaga Yang et Zhang 俗稱韭蛆,是我國北方蔬菜生產上的一種重要害蟲,其發生范圍廣,危害重,防治困難。由于常規殺蟲劑對其田間防治效果不理想,導致一些地方菜農在韭菜上大量使用高毒、劇毒、長殘留殺蟲劑防治該蟲,給人類身體健康帶來嚴重威脅。隨著全社會對綠色無公害蔬菜需求的增加,篩選高效、低毒、低殘留的防治藥劑成為當前的首要目標。目前韭蛆的室內生測方法主要有浸蟲法(賈海民,2000)、胃毒觸殺聯合毒力法(慕衛,2002)兩種。這兩種方法在試蟲齡期、試蟲飼養條件(溫度、飼料等)、浸藥和調查時間等方面均缺乏統一標準(賈海民,2000;慕衛,2002,2004,2005;王萍,2011;張思聰,2011;李娜娜,2012),如賈海民等(2000)采用4 齡幼蟲,應用浸漬法將供試幼蟲在藥液中浸漬30 s,移到蔥白上培養48 h 檢查試驗結果;慕衛等(2002)室內采用韭菜段飼養韭蛆至3 齡幼蟲,然后用蘸有藥液的濾紙加藥液浸泡15 s 后的韭菜段測定殺蟲劑的毒力,藥后72 h 檢查結果;張思聰等(2011)采用人工飼料飼養韭蛆至2 齡幼蟲用于藥劑毒力測定。處理方法及試蟲條件的不一致不利于藥劑的毒力評價和篩選。
溫度不僅影響昆蟲各蟲態發育歷期,還影響其體內生理代謝機能,尤其是與藥劑相關的一系列靶標酶和代謝解毒酶的變化會直接影響昆蟲對藥劑的敏感性。吳剛(2008)等報道了測試溫度對小菜蛾、菜縊管蚜和寄生蜂乙酰膽堿酯酶對藥劑敏感性的影響,龔忱(2011)等報道了溫度對擬環紋豹蛛乙酰膽堿酯酶體軀分布的影響,但試蟲的飼養溫度對藥劑敏感性的影響尚未見報道。從田間不同寄主植物上采自或選取室內飼喂不同食料的試蟲進行藥劑測定,可能會因食物營養成分不同而導致其體內與藥劑相關的靶標酶系、解毒酶系在質(結構)或量(酶量)上發生變化(欽俊德,1987;張勇,2005)。Swingle(1939)發現南方灰翅夜蛾幼蟲取食不同寄主植物葉片后,對砷化物的敏感性發生了變化;張勇(2005)等發現取食不同寄主的棉鈴蟲對溴氰菊酯和高效氯氰菊酯的敏感性以及其體內代謝酶活性都發生顯著變化;薛明(2005a,2005b)等采用韭菜、大蔥、圓蔥、大蒜室內飼喂韭蛆幼蟲發現對其存活率影響較大,且對辛硫磷的敏感性也有差異。此外,試蟲齡期也影響其對藥劑的敏感性(陳丙坤,2009)。為此,本試驗研究了齡期、飼養條件、生測方法等因素對韭蛆生測結果的影響,旨在為防治藥劑的篩選和科學評價提供依據。
于2012年11月,從山東省章丘市有機韭菜基地采集韭菜遲眼蕈蚊幼蟲(韭蛆),帶回實驗室內進行人工飼養。采用慕衛(2003)設計的韭菜遲眼蕈蚊人工飼養方法擴大繁殖后取適齡幼蟲供試。飼養條件為溫度25±1℃,濕度75±5%,自然光照。
韭菜(漢中韭)、大蔥(中華巨蔥)、圓蔥(紅太陽圓蔥)、人工飼料(主要成分:蘑菇粉、韭菜粉、酵母粉、瓊脂粉、防腐劑、維生素、水)根據于毅(2009)等人專利的制作工藝進行配制。
97%毒死蜱(Chlorpyrifos)原藥(山東天成農藥有限公司)、94%噻蟲胺(Clothianidin)原藥(日本住友化學株式會社)。將各原藥參考國標的方法配制成簡單劑型或母液。詳細配制方法為40%毒死蜱乳油母液:41.2% 原藥,48.8% 二甲苯,4.5%農乳500#,5.5%農乳600#;1%噻蟲胺懸浮劑母液:1.04%原藥,2%寧乳34#,0.20%黃原膠,96.76%去離子水,混合后加入鋯珠,研磨2 h 制得。
1.4.1 胃毒觸殺聯合毒力法
將潔凈濾紙平鋪在直徑9 cm 的培養皿內,在濾紙上滴加1.2 mL 藥液。將未用藥的韭菜莖基的白色部分剪成1 cm 小段,取4 段于不同濃度藥液中浸泡30 s 后取出,用吸水紙上吸去多余藥液后置于鋪有相同藥液處理濾紙的培養皿內,然后用毛筆輕輕挑取大小一致的適齡幼蟲放于培養皿內,并蓋好皿蓋。每皿接入試蟲25 頭左右,每處理重復3 次,同時設清水對照。放入25±1℃、相對濕度75±5%的無光培養箱中飼養。藥后一定時間檢查結果,以毛筆尖輕觸蟲體,幼蟲不動或身體明顯收縮者記為死亡。
1.4.2 人工飼料混藥法
本實驗室參照《農藥室內生物測定試驗準則》(2006)中的人工飼料混藥法,并加以改進。具體方法為:稱取已熔化的韭蛆人工飼料4.5 g,將稀釋好的待測藥劑母液0.5 g 均勻混入制作好的人工飼料中,制成混藥飼料,待飼料凝固后切成0.5 cm3的小塊。將藥劑母液分別稀釋10 倍,取1.0 mL 均勻滴加于平鋪在直徑9 cm 培養皿內的濾紙上。將切好的混藥人工飼料小塊置于鋪有相同濃度藥液處理濾紙的培養皿中央,然后將生長一致聚集成團的適齡幼蟲用毛筆輕輕挑至培養皿飼料小塊上。每皿接入試蟲25 頭左右,每處理重復3 次,同時設清水對照。其他試驗操作、試驗條件及結果檢查同1.4.1。
1.4.3 浸蟲法
將濾紙折成漏斗狀,用毛筆輕輕挑起聚集成團且大小一致的適齡幼蟲于濾紙中心,再用移液管吸取藥液滴于漏斗中,幼蟲在藥液中浸泡30 s后,用吸水紙吸去漏斗中多余藥液。將浸過藥液的試蟲用毛筆挑放在墊有干凈濾紙(未用藥液處理)的9 cm 培養皿內,濾紙上定量加水1.2 mL以保濕,放入新鮮韭菜莖段作飼料。每皿接入試蟲25 頭左右,每處理重復3 次,同時設清水對照。其他試驗操作、試驗條件及結果檢查同1.4.1。
分別采用2 齡和4 齡幼蟲,以毒死蜱為試驗藥劑分別用胃毒觸殺聯合毒力法、人工飼料混藥法和浸蟲法進行室內毒力測定,重復3 次。
分別取人工飼料、韭菜假莖、大蔥植株近根部的地下莖和圓蔥頭作飼料,在室內分別連續飼養韭蛆至第二代,選取第二代4 齡幼蟲采用胃毒觸殺聯合毒力法對毒死蜱、噻蟲胺進行4 齡幼蟲的室內生測試驗,重復3 次。
設定4個溫度梯度,在15℃、20℃、25℃、30℃飼養試蟲至第二代,采用胃毒觸殺聯合毒力法在25℃下進行毒死蜱對韭蛆4 齡幼蟲的室內生測試驗。
采用胃毒觸殺聯合毒力法、人工飼料混藥法和浸蟲法對毒死蜱、噻蟲胺進行不同作用方式的室內毒力評價,以4 齡幼蟲進行室內生測試驗,重復3 次。
生測數據采用DPS v7.05 軟件分析整理(唐啟義,2002)。同一生測方法不同齡期的敏感性倍數,以毒死蜱對 4 齡試蟲的致死中濃度LC50(mg/L)為標準,計算毒死蜱對二齡試蟲的LC50比值。同一方法同一藥劑處理不同飼料飼養的韭蛆4 齡幼蟲根據致死中濃度LC50(mg/L),以毒死蜱對圓蔥飼養的試蟲的LC50為標準,計算毒死蜱對其余3種飼料飼養試蟲的LC50比值,以噻蟲胺對韭菜飼養的試蟲的LC50為標準,計算噻蟲胺對其余3種飼料飼養試蟲的LC50比值。
表1 結果表明,對于同齡幼蟲,三種方法測得的LC50值均以浸蟲法最高,人工飼料混藥法次之,胃毒觸殺聯合毒力法最低;人工飼料混藥法和胃毒觸殺聯合毒力法測得的LC50值差異性不顯著。4 齡幼蟲對藥劑的耐受力顯著高于2 齡幼蟲。胃毒觸殺聯合毒力法、人工飼料混藥法和浸蟲法測得2 齡幼蟲對毒死蜱的敏感性倍數分別為4 齡幼蟲的11.9 倍、7.4 倍、3.3 倍。說明韭蛆幼蟲齡期影響藥劑毒力。

表1 三種生測方法測定毒死蜱對2 齡和4 齡幼蟲的毒力Table 1 The toxicities of chlorpyrifos on 2nd and 4th instar larvae by three different bioassay methods
采用韭菜、大蔥、圓蔥、人工飼料飼養的試蟲,測定毒死蜱、噻蟲胺對韭蛆4 齡幼蟲的毒力,結果結果見表2。不同食料飼養的韭蛆對兩種藥劑的敏感性存在較大差異。毒死蜱對取食韭菜、大蔥、圓蔥和人工飼料的韭蛆4 齡幼蟲的LC50分別為69.399 mg/L、86.801 mg/L、127.965 mg/L、55.158 mg/L,取食韭菜、大蔥、人工飼料的毒力分別為圓蔥的1.84 倍、1.47 倍、2.31 倍。其中取食人工飼料的韭蛆對毒死蜱最為敏感,取食韭菜、大蔥的較前者敏感性降低。噻蟲胺對取食韭菜、大蔥、圓蔥和人工飼料的韭蛆4 齡幼蟲的LC50分別為3.445 mg/L、2.850 mg/L、2.093 mg/L、3.092 mg/L,其中取食圓蔥的對毒死蜱最為不敏感,取食韭菜、大蔥及人工飼料的較前者敏感性升高。

表2 毒死蜱、噻蟲胺對不同食料飼養幼蟲的毒力Table 2 The toxicities to 4th instar larvae reared on different diets of chlorpyrifos and clothianidin
采用胃毒觸殺聯合毒力法測定了毒死蜱對不同溫度下飼養韭蛆的毒力(表3)。48h 毒死蜱的LC50值分別113.680 mg/L、154.299 mg/L、224.190 mg/L、254.533 mg/L,72 h 的LC50值分別為35.891 mg/L、56.362 mg/L、71.433 mg/L、77.413 mg/L。在15-30℃,隨飼養溫度的升高毒死蜱的LC50值增大,但增大的幅度不斷減小。從表3 中還可以看出,4個溫度梯度飼養的試蟲在藥后48 h 的LC50與藥后72 h 的LC50依次相差2.17 倍、1.74 倍、2.15 倍、2.29 倍。

表3 毒死蜱對不同溫度下飼養的韭蛆4 齡幼蟲的毒力Table 3 The toxicities to 4th instar larvae on different rearing temperatures to chlorpyrifos
結果見表4。三種生測方法胃毒觸殺聯合毒力法、人工飼料混藥法和浸蟲法對韭蛆4 齡幼蟲的LC50存在差異。三種測定方法測得毒死蜱對4 齡幼蟲的LC50分別為67.199 mg/L、71.123 mg/L 和88.120 mg/L。噻蟲胺對4 齡幼蟲LC50分別為3.584 mg/L、2.255 mg/L、4.329 mg/L。可見,胃毒觸殺聯合毒力法測得的毒死蜱對4 齡幼蟲的LC50最小,人工飼料混藥法次之,浸蟲法最高;而人工飼料混藥測得的噻蟲胺對4 齡幼蟲的LC50最低,胃毒觸殺聯合毒力法次之,浸蟲法最高。胃毒觸殺聯合毒力法和人工飼料混藥法測得毒死蜱的LC50差異性不顯著,但兩者均明顯高于浸蟲法測得毒死蜱的LC50。三種方法測得噻蟲胺的LC50存在明顯差異。將兩種藥劑用不同生測方法所測得的毒力回歸直線經擬合度卡方值檢驗,結果(卡方值均小于F0.05=7.82,P 均大于0.05)顯示三種生測方法測得毒力回歸直線都是合適的,但在浸蟲法測得的毒力回歸直線的擬合度要均比其他兩種方法低(F浸蟲法=1.5557>F胃毒觸殺聯合毒力法=0.7564>F人工飼料混藥法=0.3013;F'浸蟲法=1.2743>F'胃毒觸殺聯合毒力法=0.8437>F'人工飼料混藥法=0.8386)。

表4 三種不同生測方法對韭蛆4 齡幼蟲對毒死蜱、噻蟲胺生測毒力曲線和LC50的影響Table 4 Effects of toxicity curve and LC50to 4th instar larvae on three different bioassay methods

(續上表)
不同齡期試蟲對藥劑的敏感性存在顯著差異。本研究采用胃毒觸殺聯合毒力法、人工飼料混藥法、浸蟲法測得2 齡幼蟲對毒死蜱的敏感性分別為4 齡幼蟲的11.9 倍、7.4 倍、3.3 倍。浸蟲法測得的毒力敏感性差異最小,可能與其只體現了毒死蜱的觸殺作用,而胃毒作用在韭蛆致死效應中起更大作用有關。另外試驗中也發現,2 齡幼蟲體型偏小,操作不便,容易因機械外力而死亡,且存在檢查結果時其中毒癥狀難觀察、死亡與否難以判定等問題。這與Cloyd(2006)等人在研究新煙堿類殺蟲劑、蘇云金桿菌對眼蕈蚊Bradysia spp.(Diptera:Sciaridae)的防治效果時建議不宜采用2齡幼蟲進行試驗的解釋是一致的。
毒死蜱屬于有機磷類殺蟲劑,作用靶標是乙酰膽堿酯酶,其敏感度降低是昆蟲對該類殺蟲劑產生抗性的重要機制。薛明(2005b)等研究發現大蔥、圓蔥中含有硫醚類物質對韭蛆體內乙酰膽堿酶和代謝酶的誘導或抑制是引起藥劑敏感性差異的重要原因。韭蛆幼蟲長時間取食韭菜、人工飼料、大蔥、圓蔥后,其體內乙酰膽堿酶和代謝酶可能存在質或量的差異,導致毒死蜱對4種食料飼養的幼蟲毒力顯著差異。而噻蟲胺屬于新煙堿類殺蟲劑,此類藥劑作用于煙堿型乙酰膽堿受體。噻蟲胺對取食上述4種食料幼蟲的毒力存在差異,但其毒力大小順序與毒死蜱的不同。因此,推測兩種藥劑表現出的差異可能與其作用機制有關。這種取食方面的差異對藥劑對試蟲敏感性的影響與張勇(2005)、Swingle(1939)、吳承春(2003)等人的研究結論一致。
溫度不僅影響韭蛆各蟲態的發育歷期,還影響其體內的生理代謝功能。本試驗在測定不同飼養溫度對毒力的影響時,采用了同一生測溫度。根據龔忱(2011)、吳剛(2003)等分別報道的溫度對乙酰膽堿酯酶的體軀分布和藥劑敏感性的影響的研究結果,本試驗中飼養溫度對乙酰膽堿酯酶在韭蛆體軀的分布及含量可能也存在影響,從而導致了毒死蜱對不同溫度下飼養韭蛆的毒力變化,具體的生理生化機制還需要進一步探討。室內飼養條件(溫度、飼料等)的差異性,會導致試蟲對藥劑敏感性的差異。因此,室內不同飼養條件下的試蟲測得藥劑毒力無法進行比較,毒力測定必須選用同等條件下統一飼養的試蟲。
胃毒觸殺聯合毒力法、人工飼料混藥法和浸蟲法均能夠滿足藥劑對韭蛆的室內毒力測定要求,但胃毒觸殺聯合毒力法和人工飼料混藥法優于浸蟲法。浸蟲法雖簡單易行,但對非觸殺型藥劑毒力測定不夠準確;胃毒觸殺聯合毒力法測定結果準確度高,但需確保韭菜、大蔥等試驗材料來源不受農藥污染,需要避免浸藥不充分、浸藥后易腐爛等問題,否則會導致試驗結果的波動;而采用改進的人工飼料混藥法相對于胃毒觸殺聯合毒力法和浸蟲法,測定結果準確度高,可以作為韭菜短缺時的一種替代方法。
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