三種食源性致病菌揮發性代謝產物譜快速檢測研究

操慶國，郭 欽 ，劉 涵，徐海棠，李東成

(1．江蘇農林職業技術學院生物工程系，江蘇句容 212000;2．江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013)

微生物揮發性代謝產物(MVOCs)是一類親脂、低分子量(一般100～300u)、常溫常壓下易揮發的含碳化合物，其包含很多微生物有用的生物信息［1-2］。MVOCs譜具有種屬特異性，多數由濃度不等的混合物組成，是微生物特定生理代謝活動途徑的后果。特定的細菌產生特定代謝產物，如胺、氨氣、吲哚、酯類和醇類等。MVOCs可以促進或抑制特定植物的生長、調節細菌和真菌種間和種內的相互作用、防止昆蟲蟲害，也可以作為檢測特定細菌的方法之一、或作為檢測人體疾病、食品腐敗或房屋中霉菌生長的標記物［3-4］。某些MVOCs如高級醇類還可以作為生物柴油被利用。目前，已經建立的 MVOCs數據庫(http://bioinformatics．charite．de/mvoc)已收集 349 種細菌和69種真菌近1000種代謝產物，并闡明了其結構和代謝途徑。

副溶血弧菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌是重要的食源性致病菌，每年引起多起食品中毒事件，造成了較大的經濟損失和人員傷害。已經開發了多種檢測方法，如傳統的生化檢驗、PCR和多重PCR、熒光定量PCR、ELISA快速檢測試劑盒和LAMP等，但這些方法都存在不足之處，如檢測時間長、成本過高、操作步驟復雜和假陽性高等，因此建立一種快速、簡便、無損的副溶血弧菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌檢測方法已迫在眉睫。當副溶血弧菌等細菌污染食物后，其在食物中早期生長時會散發出獨特的 MVOCs，這些成分會在空氣中擴散，因此對MVOCs的檢測要早于后期細菌的可視見生長，有助于防止食物的進一步腐敗，預防食物中毒。由于在細菌毒素合成之時，也會有對應的MVOCs散發，因此MVOCs的檢測還可以判斷食物中是否有食源性致病菌毒素的產生［5］。

本文主要通過SPME-GC-MS(固相微萃取-氣質聯用)聯用，對以上三種食源性致病菌進行MVOCs譜的檢測，研究其變化規律，找到其在各個生長時期的特征性揮發性代謝產物成分，從而為三種食源性致病菌的快速檢測奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

致病性副溶血弧菌(tdh+)VP-62和VP-73菌株 鎮江市疾控中心;大腸桿菌1．02389和金黃色葡萄球菌金黃亞種1．02465 中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)。TCBS培養基、BHI培養基、TSI培養基和LB培養基 青島高科園海博生物技術有限公司;無水乙醇、氯化鈉等其他化學試劑 華東國藥集團化學試劑有限公司(上海)。

1.2 主要儀器與設備

超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司;LRH-250生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;電子天平 上海精科天平儀器廠;3110-P1000型移液槍 德國Eppendorf公司;全自動高壓蒸汽滅菌鍋 鳥取三洋電機(廣州)有限公司;臺式高速冷凍離心機湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司;GC-MS(氣相色譜質譜聯用儀) 美國安捷倫科技有限公司;固相微萃取裝置 美國安捷倫科技有限公司;手動SPME進樣器 上海安普儀器有限公司;XH-C旋渦混合器江蘇金壇市醫療儀器廠。

1.3 實驗方法

1．3．1 副溶血弧菌的培養和純化 從25℃保存的TSI斜面培養基挑取菌體，反復劃線于TCBS平皿上，37℃生化培養箱中培養18～24h，挑取綠色單菌落進行下一步實驗。

1．3．2 副溶血弧菌的定時取樣 從TSI斜面培養基上挑取菌體，轉接到BHI液體培養基中，37℃振蕩培養18～24h。從活化后的液體培養基中吸取200μL菌液分別接種于裝有5mL BHI液體培養基的15mL頂空瓶中，37℃振蕩培養，于0、8、18、30、42、54h 定時取樣，進行SPME-GC-MS檢測。

1．3．3 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養和純化從4℃保存的LB斜面培養基中挑取菌體，反復劃線于LB平板上，37℃生化培養箱中培養12h，挑取單菌落進行下一步實驗。

1．3．4 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的定時取樣 挑取純化好的單菌落，轉接到LB液體培養基中，37℃振蕩培養10～12h。從活化后的液體培養基中吸取200μL的菌液分別接種于裝有5mL LB液體培養基的15mL 的頂空瓶中，37℃振蕩培養，于 0、4、8、12、16、20、24h 定時取樣，進行 SPME-GC-MS 檢測。

1．3．5 固相微萃取條件 用老化時間和老化溫度65μm萃取頭(Supelco)進行萃取。在加有5mL發酵液的15mL頂空瓶中插入萃取頭，37℃預熱5min，萃取吸附30min，GC解吸5min(250℃)，用于 GC-MS分析。

1．3．6 GC-MS分析條件 色譜柱為 AB-1701毛細管柱(30m ×0．25mm，i．d．× 0．25μm);升溫程序:45℃保持4min，以8℃/min的速度升溫至220℃，保持5min;載氣 He 流速 1．0mL/min，進樣量 1μL，不分流進樣。質譜條件:電子轟擊(EI)離子源;電子能量為70eV;離子源溫度為 230℃;質量掃描范圍 m/z 35～500。

2 結果與討論

2.1 萃取頭的選擇

SPME有多種萃取頭，非極性的100μm PDMS纖維頭對非極性、弱極性或親脂性組分靈敏度較高;弱極性的65μm PDMS/DVB纖維頭對極性和非極性組分都有較好的吸附能力;75μm CAR/PDMS纖維頭對于揮發性較強的如氣體硫化物有很好的吸附能力。分別用這三種萃取頭，對VP-62 54h培養物進行了SPME-GC-MS的測定，結果如表1所示。

從表1可以看出，65μm PDMS/DVB纖維頭出峰數和可檢出化合物數較多，對于極性、非極性和弱極性的揮發性化合物都具有很強的吸附能力。因此選擇65μm PDMS/DVB纖維頭進行三種食源性致病菌揮發性代謝產物譜的測定。

2.2 萃取條件優化

SPME分析結果除與纖維頭本身的性質相關外，還與萃取時間、萃取溫度、萃取頭浸入深度等相關。

由于人體溫度接近37℃，細菌的最適培養溫度為37℃，因此選擇37℃作為萃取溫度;以VP-62 54h培養物為樣品，選用65μm PDMS/DVB萃取纖維頭，比較不同萃取時間對萃取結果的影響，結果如表2。

如表2所示，隨著萃取時間的延長，出峰數不斷增加，但當萃取時間超過30min后，出峰數雖然繼續增加，但相差不大。萃取時間過長會使SPME纖維頭帶上大量水分，從而影響GC-MS的檢測效果，因此選擇30min作為萃取時間進行后續實驗。

表2 不同萃取時間對萃取結果的影響Table 2 The effects of different extraction time on the extraction results

2.3 微生物揮發性代謝產物譜(MVOCs)分析

2．3．1 副溶血弧菌MVOCs譜分析 對2株副溶血弧菌和BHI空白培養基進行萃取，GC-MS檢測發酵液中MVOCs成分，分析副溶血弧菌揮MVOCs的變化趨勢，結果如圖1所示。VP-62和VP-73在不同時間段MVOCs出峰數不同，隨培養時間延長逐漸增加，均在30h時達到最大值，分別有41和37個峰，其后VP-62的出峰數迅速下降，而VP-73的出峰數在42h后又迅速上升。

圖1 副溶血弧菌揮發性代謝產物變化趨勢Fig．1 The trends of volatile metabolites of Vibrio parahaemolyticus VP-62 and VP-73

對副溶血弧菌的MVOCs譜進行分析(表3)，發現八甲基環四硅氧烷、十甲基環戊硅氧烷和六甲基環三硅氧烷含量較高，但這三種屬于柱流失成分，應該與細菌代謝無關。除此之外，BHI空白培養基MVOCs能檢出19種物質，其主要成分為(3-甲氧基-苯基)-(6-甲基-4-苯基喹唑啉-2-基)-胺、2，5-雙(1，1-二甲基乙基)-苯酚和4-甲基-2-三甲基甲硅烷氧基-三甲基甲硅烷基酯苯甲酸。培養30h的VP-62和VP-73 MVOCs譜略有差異，可檢出化合物分別為28和31個，包括烷、酸、醇、醚和肟等多種中間代謝產物和有機物。兩者MVOCs譜都產生了相同的主要特征成分2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶、二叔丁基過氧化氫、3-甲基-1-丁醇等，而BHI培養基則缺乏這些成分，表明它們是由副溶血弧菌代謝過程中獨特產生。副溶血弧菌一般都分泌胞外蛋白酶和脂肪酶，喜歡污染肉類食品，BHI培養基的主要成分為牛腦、牛心浸出物、蛋白胨和葡萄糖，營養豐富，蛋白質含量較高，因此其可以把培養基中的蛋白質和氨基酸分解成含硫和胺類化合物，脂肪則被氧化成過氧化物，進而分解為醛、酮等，糖類等則被分解成酸、醇等［6］。烷烴類的物質可能是脂肪降解和氧化的次級產物。這些成分混合在一起賦予副溶血弧菌發酵產物不愉快的腐敗臭味，也具有一定的毒性。如2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶是一種化學防腐劑“果立鮮”的主要成分，二叔丁基過氧化氫和3-甲基-1-丁醇對粘膜及腸道有刺激作用，可引起灼燒感、頭痛、惡心及嘔吐等過敏反應，對該菌引起的胃腸道炎癥有一定貢獻。

圖2 副溶血弧菌VP-62和VP-73培養12h發酵液總離子流色譜圖Fig．2 The total ion chromatograms of V．parahaemolyticus VP-62(a)and VP-73(b)after 12h culture

2．3．2 大腸桿菌和金黃色葡萄球菌揮發性代謝產物檢測

2．3．2．1 大腸桿菌揮發性代謝產物檢測 對大腸桿菌1．02389發酵產物和LB空白培養基進行選擇性萃取，用GC-MS對發酵液中MVOCs進行檢測，分析大腸桿菌MVOCs的變化規律，結果如圖3所示。LB空白培養基經GC-MS分析后共檢測到51個峰，可檢出化合物為44個。大腸桿菌1．02389不同培養時間出峰數略有不同，隨時間的增加，出峰數先下降再升高，12h時達到最大值，有55個峰，可檢出化合物為42個，其后出峰數迅速下降，16h后保持穩定。大腸桿菌MVOCs出峰數的變化可能跟其生長時期相關，對數期出峰較多，變化較大，穩定期后出峰數下降且

維持恒定。

表3 副溶血弧菌MVOCs譜Table 3 The MVOCs spectrum of V．parahaemolyticus

圖3 大腸桿菌揮發性代謝產物變化規律Fig．3 The changes of volatile metabolites of E．coli

圖4 空白LB培養基總離子流色譜圖Fig．4 The total ion chromatograms of control

圖5 大腸桿菌1．02389培養12h總離子流色譜圖Fig．5 The total ion chromatograms of E．coli after 12h culture

大腸桿菌培養12h的MVOCs成分如表4，峰圖見圖5。從表4中看出，除掉柱流失成分外，LB空白培養基中主要成分為2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶和2，4-雙(1，1-二甲基乙基)苯酚等酮類、苯酚類成分;而培養12h的大腸桿菌發酵液中MVOCs譜主要成分為烷類、烴類、雜環類和醇類化合物，其生長代謝產生了區別于LB的特征性揮發性物質，如硫代乙酸S-［8-(二乙基膦酰基)辛基］酯、1，3-二苯基-1-(三甲基甲硅烷氧基)-1-庚烯、環十二烷、2-甲基-1-丁醇和八溴癸等，這些物質都屬于化學中間體，對皮膚和粘膜都具有刺激作用，可引起眩暈、嘔吐及紫紺等反應。

2．3．2．2 金黃色葡萄球菌揮發性代謝產物檢測 用SPME-GC-MS檢測金黃色葡萄球菌發酵液MVOCs變化規律，結果如圖6所示。隨培養時間增加，金黃色葡萄球菌出峰數迅速下降，之后快速上升，8h達到最大值，有60個峰，可檢出化合物為47個，其后出峰數慢慢下降，16h后保持穩定。MVOCs出峰數的變化可能跟其生長周期相關，對數期最高，穩定期后出峰數保持恒定。

金黃色葡萄球菌MVOCs譜成分較多(表4)，培養8h產生的區別于LB培養基的特征性揮發性成分為吲嗪、3-甲基丁酸和4-甲氧基芐腈。其中，吲嗪又稱為中氮茚，是吲哚的異構體之一，具有強烈臭味，其衍生物在生物、醫藥等領域具有廣泛的應用。研究結果表明，金黃色葡萄球菌的生長代謝產生了特征性的揮發性物質。

圖6 金黃色葡萄球菌1．02465揮發性代謝產物變化規律Fig．6 The changes of volatile metabolites of Staphylococcus aureus

圖7 金黃色葡萄球菌1．02465培養12h總離子流色譜圖Fig．7 The total ion chromatograms of S．Aureus after 12h culture

3 結論

目前，SPMEGC-MS作為一種快速檢測手段，已應用于食品風味和有害成分分析、食品微量元素檢測、食品中農藥和有機物殘留及微生物MVOCs的快速定性、定量測定［7］。

不同微生物MVOCs譜區別較大，如鏈霉菌屬和黃色粘球菌可分別產生26和42種揮發性代謝產物，本研究中兩株副溶血弧菌MVOCs在30h有28和31種成分，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌則分別為42和47種。隨培養時間延長，微生物MVOCs譜逐漸變化［8］，研究表明，這三種致病菌一般在對數期時MVOCs譜成分能達到最大值，穩定期后逐漸保持恒定，這可能是因為對數期細菌生長活躍、新陳代謝旺盛，所以產生的特征性代謝產物較多，因此當這三種致病菌污染食物時，應盡量在早期進行MVOCs譜測定。

續表

續表

每一個細菌都有其獨特的MVOCs成分，如丙酮丁醇梭菌為丁酸和丙酮，嗜酸耐熱菌的主要代謝產物為愈創木酚和2，6-二溴苯酚等［9］，這些特征性成分可以檢測該種細菌的生長和污染狀況的標記物，從而建立細菌快速檢測平臺。如煙酸甲酯可以作為檢測和診斷結核分枝桿菌的非侵入性方法，2-壬酮可以在體外作為檢測銅綠假單胞菌感染肺炎的標記物［4］，葡萄穗霉在任何培養基上都會產生苯甲醚作為特征性成分［5］。本研究發現，2-氯-4-(4-甲氧基苯基)-6-(4-硝基苯基)嘧啶、二叔丁基過氧化氫、3-甲基-1-丁醇等也許可以作為判斷副溶血弧菌生長的標記物，環十二烷和吲嗪等也許能作為判斷大腸桿菌和金黃色葡萄球菌污染肉類食品的標記物，但這還需要進一步的研究和比對。

運用GC-MS-SPME檢測致病菌的特征性MVOCs，可建立肉制品和水產品的在線安全檢測平臺，具有無損、快速、樣品用量低等優點，并能在早期及時發現其對牛肉、雞肉等的污染程度，避免食物中毒，挽回經濟損失，因此具有較好的發展前景［10］。

［1］Zhang ZM Zhang，Li GK．A Review of Advances and New Developments in the Analysis of Biological Volatile Organic Compounds［J］．Microchemical Journal，2010，95:127-139．

［2］Hock B．The Mycota(IX):Fungal Associations［M］．Berlin，Heidelberg:Springer-Verlag Berlin and Heidelberg GmbH＆Co．K，2000．

［3］Kai M，Haustein M，Molina F，et al．Piechulla Bacterial Volatiles and TheirAction Potential［J］．ApplMicrobiol Biotechnol，2009，81:1001-1012．

［4］Betancourt DA，Krebs K，Moore SA，et al．Microbial Volatile Organic Compound Emissions from Stachybotrys ChartarumGrowing on Gypsum Wallboard and Ceiling tile［J］．BMC Microbiology，2013，13:283-289．

［5］許傳坤，莫明和，張克勤．固相微萃取-氣質法測定土壤揮發性抑菌物質［J］．微生物學通報，2004，31(5):14-19．

［6］楊康，岳田利，袁亞宏，等．利用頂空SPME-GC-MS聯用技術檢測蘋果汁中嗜酸耐熱菌代謝產物的研究［J］．農產品加工，2007，94(3):8-12．

［7］梁華正，張燮，饒軍，等．微生物揮發性代謝產物的產生途徑及其質譜檢測技術［J］．中國生物工程雜志，2008，28(1):124-33．

［8］金偉平，黃志強，劉群群．頂空固相微萃取-氣質聯用法分析單增李斯特菌污染冷藏牛肉的揮發性物質［J］．食品科學，2012，33(2):243-248．

［9］Lemfack MC，Nickel J，Dunkel M，et al．mVOC:a Database of Microbial Volatiles［J］．Nucleic Acids Research，2014(42):744-748．

［10］李雅萍，賀麗蘋，陳玉芬，等．SPME-GC/MS聯用技術分析蜂膠中揮發性成分的研究［J］．現代食品科技，2007，23(7):78-80．