表面活性劑輔助提取石榴葉中總黃酮工藝的研究

宮 坤，詹小龍，郭中婷，薛建平2，，李進步2，，盛 瑋2，，*

(1．淮北普豪生物科技有限公司，安徽濉溪234100;2．資源植物生物學安徽省重點實驗室，安徽淮北235000;3．淮北師范大學生命科學學院，安徽淮北235000)

石榴葉是石榴科植物石榴(Punica granatum L．)的葉，中國石榴以產果為主，重點產區有安徽懷遠、淮北，陜西臨潼，山東棗莊，云南巧家，四川會理和新疆和田等地區。《圖紀本草》記載:“榴葉者，主咽喉燥渴、止下利漏精、止血之功能”。據報道，已從石榴葉中分離出熊果酸、甘露醇、白樺脂酸、菟單寧以及鞣花單寧、鞣花酸、沒食子酸、短葉蘇木酚、木犀草素4'-O-β-葡萄糖苷、黃酮苷類等20多種化合物［1］。其黃酮類物質的含量較高［2-3］，而天然植物黃酮類化合物具有降脂、抗心血管疾病、消除自由其及抗氧化、抗骨質疏松、防癌抗癌等作用［4-6］，可廣泛用于醫藥、化妝品［7］、食品等行業，具有廣泛的開發應用前景。

表面活性劑可顯著降低固-液相的界面張力，增加生物大分子的溶解滲出能力，在天然產物提取過程中，具有縮短浸提時間，降低有機溶劑用量，提高提取率等優點。已有研究者利用表面活性劑的增溶、潤濕作用，開展了表面活性劑協同提取天然產物活性成分的研究［8-11］，用溶有少量表面活性劑的溶劑代替高濃度有機溶劑提取天然活性物質，以提高提取率，降低提取成本。本研究以含有少量表面活性劑的低濃度乙醇溶劑替代高濃度的乙醇溶劑進行石榴葉中總黃酮的提取，在單因素實驗結果基礎上，通過正交實驗，優化石榴葉中總黃酮的提取條件，為安徽淮北石榴葉資源的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石榴葉 十月下旬采收于淮北塔山，干燥、粉碎后過20目備用。

吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、司班-20、司班-85、單硬脂酸甘油酯、95%乙醇、濃鹽酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等均為分析純。蘆丁標準品(≥98%) 中國藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設備

W21-420型三用電熱恒溫水浴鍋 天津市秦斯特儀器有限公司;RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;UV-4802型紫外可見分光光度計 尤尼科上海儀器有限公司;JA2003電子天平 上海良平儀器儀表有限公司;FDV超微粉碎機 北京環亞天元機械技術有限公司。

1.3 實驗方法

1．3．1 黃酮類化合物含量測定 蘆丁標準溶液的配制及標準曲線的制定［12］:準確稱取蘆丁標準品10．00mg，用75%的乙醇溶解并定容至50mL，其濃度為 0．200mg/mL 的蘆丁標準溶液。準確吸取 0．0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5mL 標準溶液于 10mL 的容量瓶中，再分別加入0．3mL濃度為5%的NaNO2溶液，搖勻，放置6min后加入0．3mL 10%Al(NO3)3溶液，搖勻，放置6min，加入4．0mL濃度為4%的NaOH溶液，最后用75%的乙醇定容至刻度，搖勻，靜置12min，在508nm處測定吸光度。

黃酮類化合物含量的測定:取石榴葉提取液1．0mL置于 10mL的容量瓶中，分別加入 5%的NaNO2溶液 0．3mL，搖勻，放置 6min后加入 10% 的Al(NO3)3溶液 0．3mL，搖勻，放置 6min 后，再加入4%的NaOH溶液4．0mL，最后用75%的乙醇定容至刻度，搖勻，靜置12min，在508nm處測定吸光度，根據線性回歸方程換算成樣品中的總黃酮含量。

1．3．2 石榴葉總黃酮提取單因素研究

1．3．2．1 表面活性劑的選擇 按料液比1∶30(g/mL)加入30%的乙醇溶液為浸提劑，分別加入4%的不同表面活性劑，在 60℃浸提 60min，過濾定容后，按1．3．1方法測定提取液的吸光度大小。

1．3．2．2 表面活性劑濃度的選擇 按料液比1∶30(g/mL)加入30%的乙醇溶液為浸提劑，分別加入不同量的吐溫-40，在60℃浸提60min，過濾定容后，按1．3．1方法測定提取液的吸光度大小。

1．3．2．3 乙醇濃度的選擇 按料液比 1∶30(g/mL)加入不同濃度的乙醇溶液為浸提劑，加入 2．4%吐溫-40，在60℃溫度下浸提60min，過濾定容后，按1．3．1方法測定提取液的吸光度大小。

1．3．2．4 浸提溫度的選擇 按料液比 1∶30(g/mL)加入30%的乙醇溶液為浸提劑，加入2．4%吐溫-40，分別在不同溫度下浸提60min，過濾定容后，按1．3．1方法測定提取液的吸光度大小。

1．3．2．5 浸提時間的選擇 按料液比 1∶30(g/mL)加入30%的乙醇溶液為浸提劑，加入2．4%吐溫-40，在60℃浸提不同時間，過濾定容后，按1．3．1方法測定提取液的吸光度大小。

1．3．2．6 料液比的選擇 準確稱取一定量的石榴葉粉，按不同的料液比加入含有2．4%吐溫-40的30%乙醇溶液浸提劑，在60℃保溫浸提60min，過濾定容后，按1．3．1方法測定提取液的吸光度大小。

1．3．3 石榴葉總黃酮提取工藝的優化 在單因素實驗的基礎上，選取影響石榴葉總黃酮提取效果各因素中有意義的水平做正交實驗，對結果進行極差分析，以確定最佳的提取條件。采用L9(34)正交表，浸提時間為60min，以吐溫-40濃度(A)、乙醇體積分數(B)、料液比(C)、浸提溫度(D)作為4個考察因素，選取3個水平進行實驗(見表1)。

表1 提取石榴葉總黃酮工藝L9(34)正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels for L9(34)orthogonal array design

1．3．4 石榴葉總黃酮提取率的計算

式中，c為每級提取液黃酮的含量(mg/mL);V為每級提取液的體積(mL)。

1．3．5 數據統計分析 所有的實驗均重復3次，利用SPSS 20軟件對實驗結果進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 總黃酮測定的標準曲線

在400～700nm波長下掃描，結果顯示在508nm波長處有最大吸收峰。故在波長508nm處測定各濃度標準溶液的吸光度，以吸光度對質量濃度做標準曲線，其線性回歸方程為 A=11．276C-0．012 5，R2=0．9998。

2.2 不同表面活性劑對石榴葉總黃酮提取效果的影響

由圖1可知，表面活性劑都能顯著提高石榴葉中總黃酮的提取率(與CK相比p＜0．05)，以吐溫-40提取的總黃酮得率最高，與對照相比，吐溫-40的加入能極顯著提高總黃酮的得率(與 CK相比 p＜0．01)，比空白對照提高了 0．52 倍，同時吐溫-20、吐溫-60、吐溫-80也分別將石榴葉總黃酮的得率提高了 0．35 倍、0．46 倍和 0．40 倍，而同樣條件下，加入其他種類表面活性劑后總黃酮得率也提高，但沒有吐溫系列提高的顯著。因此，選擇吐溫-40為表面活性劑用于石榴葉總黃酮的提取。

2.3 不同濃度表面活性劑對石榴葉總黃酮提取效果的影響

圖1 不同表面活性劑對石榴葉總黃酮提取效果的影響Fig．1 Effects of surfactant type on extraction

由圖2可知，隨著表面活性劑濃度的增加，石榴葉總黃酮提取率也增大，當表面活性劑濃度為2．4%時，石榴葉總黃酮提取率已達到較好水平，再增加表面活性劑的濃度，石榴葉總黃酮提取率變化不大。表面活性劑用量太大，不僅增加生產成本，并且會使過濾過程中產生較多的泡沫，增加過濾難度，因此表面活性劑的用量在1．6%～3．2%之間。

圖2 不同濃度表面活性劑對石榴葉總黃酮提取效果的影響Fig．2 Effects of different surfactant concentration on extraction

2.4 不同乙醇濃度的浸提劑對石榴葉總黃酮提取效果的影響

由圖3可知，乙醇濃度在0～30%范圍內，隨著乙醇濃度增加，石榴葉總黃酮提取率增加，但乙醇濃度超過30%時，石榴葉總黃酮提取率沒有明顯的變化，故提取劑乙醇濃度以30%左右為宜。

圖3 不同乙醇濃度對石榴葉總黃酮提取效果的影響Fig．3 Effects of different ethanol concentration on extraction

2.5 浸提溫度對石榴葉總黃酮提取效果的影響

由圖4可知，在40～70℃范圍內，隨著溫度升高，石榴葉總黃酮提取率增加，但超過80℃，石榴葉總黃酮提取率下降。提取率下降的主要原是隨著溫度的升高浸提劑揮發加快，故提取溫度不超過80℃為宜。

圖4 浸提溫度對石榴葉總黃酮提取效果的影響Fig．4 Effects of different extraction temperature on extraction

2.6 浸提時間對石榴葉總黃酮提取效果的影響

由圖5可知，在60min時間內，隨時間的延長，石榴葉總黃酮提取率迅速增加。超過120min后，石榴葉總黃酮不再增加，反而出現下降，這可能是由于石榴葉黃酮降解及提取劑揮發所致。從生產成本考慮，提取時間越長，能耗越大，故提取時間以60min左右為宜。

圖5 浸提時間對石榴葉總黃酮提取效果的影響Fig．5 Effects of different extraction time on extraction

2.7 料液比對石榴葉總黃酮提取效果的影響

由圖6可知，料液比在 1∶10～1∶25 范圍內，黃酮提取率隨料液比的增加顯著提高，其原因可能是隨著料液比的增加黃酮的傳質動力也增加，使得原料中更多的黃酮融入提取劑中。當料液比超過1∶30時，黃酮的提取率沒有顯著變化，考慮到溶劑成本及濃縮過程能量的消耗，因此，石榴葉總黃酮提取料液比以不超過1∶30為宜。

圖6 料液比對石榴葉總黃酮的浸提效果Fig．6 Effects of different ratio of material to solvent on extraction

2.8 正交實驗優化石榴葉總黃酮的提取工藝

根據單因素實驗結果進行L9(34)正交實驗，其實驗結果如表2，由表2中極差R值大小可見，各因素影響大小依次為C＞A＞B＞D，即影響石榴葉總黃酮提取率是料液比＞吐溫-40濃度＞乙醇濃度＞浸提溫度。方差分析(表3)表明，料液比及吐溫-40濃度對石榴葉總黃酮提取率的影響極顯著，乙醇濃度對石榴葉總黃酮提取率的影響顯著，而浸提溫度對石榴葉總黃酮提取率的影響不顯著。因此優選出來的表面活性劑輔助提取石榴葉總黃酮的最佳工藝條件為:A2B3C3D2即表面活性劑吐溫-40的質量濃度為2．4g/100mL、提取劑乙醇的濃度為40%、料液比為1∶30，浸提溫度為60℃。在此條件下，進行3次重復的驗證實驗，按測定黃酮的含量方法測定提取液的吸光度為 1．973，其石榴葉總黃酮的提取率為 86．17% 。

表3 石榴葉總黃酮提取正交實驗方差分析結果Table 3 Analysis of variance for the orthogonal array design

表2 提取石榴葉總黃酮工藝L9(34)正交實驗設計及結果Table 2 L9(34)orthogonal array design and results

2.9 浸提次數對石榴葉總黃酮提取效果的影響

準確稱取石榴葉粉，每次在最佳條件下提取，結果見表 4。由表 4可知，第 1次的提取率高達86．17%，第2 次的提取率為 8．52%，第 3 次的僅為3．76%，3次總的提取率達到98．45%。考慮到溶劑成本及濃縮過程能量的消耗，石榴葉總黃酮浸提次數以1次為宜。

表4 提取次數對石榴葉總黃酮提取率的影響Table 4 Effects of different times on extraction efficiency

3 結論與討論

3.1 在單因素實驗基礎上，采用正交實驗設計對影響石榴葉總黃酮提取效果的提取溶劑乙醇濃度、料液比、提取時間、吐溫-40濃度等4個因素進行了研究。結果表明各因素對其提取率的影響顯著程度由大到小依次為:料液比＞吐溫-40濃度＞乙醇濃度＞浸提溫度，即料液比與吐溫-40濃度對石榴葉總黃酮提取率影響極顯著，提取溶劑乙醇濃度對石榴葉總黃酮提取率影響顯著，而提取溫度對提取效率影響相對較小。其石榴葉總黃酮的最佳提取條件為:表面活性劑吐溫-40的質量濃度為2．4g/100mL、提取劑乙醇的濃度為40%、料液比為1∶30，浸提溫度為60℃、提取時間60min。在此條件下提取1次，石榴葉總黃酮的提取率為86．17%。

3.2 表面活性劑具有特定的親水-親油雙親結構，可降低細胞膜與水溶液間的界面張力，增大細胞內外濃度差，提高細胞內部系統含水量，有助于提高不易溶于水的物質在水中的溶解度，縮短提取時間，增加提取效率。因此，利用表面活性劑輔助提取石榴葉總黃酮，縮短了提取時間，降低提取劑乙醇的含量［13-14］，具有省時、高效、節能及降低生產成本等優點。

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