表面活性劑輔助酶法提取黃芪黃酮的工藝優(yōu)化

王 超，杜 冰，謝藍(lán)華，張嘉怡，林鳳英，楊公明

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州510642)

黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的根［1］。黃芪的主要生理活性物質(zhì)有多糖、類黃酮、皂苷三大類［2］，黃酮類化合物具有抗氧化、抗腫瘤、延緩衰老及降血糖、降血壓、降血脂、抗炎鎮(zhèn)痛等作用［3-4］，因而受到國內(nèi)外的廣泛關(guān)注。目前，黃芪黃酮類化合物的主要提取方法有:超聲提取法［5］、有機溶劑提取法［6］、纖維素酶提取法［7］、閃式提取法［8］等，應(yīng)用最為廣泛的是有機溶劑提取法，由于植物類黃酮存在于細(xì)胞內(nèi)，常規(guī)的乙醇提取法無法使細(xì)胞壁完全破裂，類黃酮的溶出存在較大阻力，造成得率低和提取成本較高。

近年來，國內(nèi)外已有利用表面活性劑的增溶作用協(xié)同提取天然產(chǎn)物活性成分的研究，該法通常是以溶有少量表面活性劑的水替代高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的醇或其他有機溶劑進行活性成分的提取，能大大降低提取成本，并提高得率［9-10］。此外，表面活性劑對木質(zhì)素具有吸附作用，可以阻止纖維素酶與木質(zhì)素的無效結(jié)合［11］，對纖維素酶具有穩(wěn)定效應(yīng)，在水解過程中可有效阻止纖維素酶的變性［12］，從而提高纖維素酶的水解效率。

本文在常規(guī)的乙醇提取法之前，對黃芪進行表面活性劑輔助酶預(yù)處理，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken的中心組合實驗，并且利用Design-Expert8．0軟件進行響應(yīng)面優(yōu)化分析，確定黃芪黃酮的最佳提取工藝參數(shù)，以期為黃芪深加工提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒙古黃芪藥材 內(nèi)蒙古烏蘭察布市廣一中藥材種植有限公司提供;纖維素酶(酶活力≥6200IU/g)廣州柏棠貿(mào)易有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇、冰醋酸、無水乙酸鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、溴化十六烷基三甲胺(CTMAB)、吐溫-80、吐溫-20、十二烷基苯磺酸鈉(LAS) 分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

液氮粉碎機 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院中低溫加工研究中心研制;JA-2003型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;722E型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津太斯特儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋 金壇市精達(dá)儀器制造廠;PHS-3C酸度計 上海理達(dá)儀器廠;HJ-3型恒溫磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空抽慮機 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1．2．1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 根據(jù)文獻(xiàn)［13］，將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于105℃干燥至恒重后，精密稱取20mg用80%乙醇溶解，定容至100mL，得濃度為0．200mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液 0、1．0、2．0、3．0、4．0、5．0、6．0mL 于25mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0．3mL，搖勻放置 6min 后加入 10%Al(NO3)3溶液0．3mL，搖勻放置 6min后加入 4%NaOH溶液4mL，用80%乙醇溶液定容，搖勻，10min后用1cm比色皿于510nm測定吸光度A。

1．2．2 總黃酮含量的測定 按照測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液吸光度的步驟測定吸光度X，計算黃芪黃酮的含量，重復(fù)3次，取平均值。黃芪黃酮得率按下列公式計算。

式中:C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出的樣品的黃酮濃度，mg/mL;V為樣品溶液的體積，mL;D為樣品的總稀釋倍數(shù);m為樣品的質(zhì)量，mg。

1．2．3 黃芪黃酮提取工藝 黃芪烘干、經(jīng)液氮粉碎機粉碎后過60目篩。準(zhǔn)確稱取黃芪干粉5．000g，在pH4．0，溫度50℃的條件下經(jīng)不同表面活性劑、一定質(zhì)量的纖維素酶處理1h，升溫滅酶;抽濾，蒸發(fā)濃縮得濾液A，濾渣加一定濃度的乙醇溶液30mL并調(diào)pH至7，一定溫度下提取一段時間后，抽濾，蒸發(fā)濃縮得濾液B，濾渣用同濃度的乙醇溶液洗滌3次，得濾液C，合并濾液，用同濃度乙醇溶液定容至100mL。

1．2．4 單因素實驗設(shè)計 在表面活性劑添加量0．2%、酶添加量 0．2%、乙醇濃度 80%、提取溫度80℃、提取時間2h的條件下，考察表面活性劑十六烷基硫酸鈉(SDS)、溴化十六烷基三甲胺(CTMAB)、十六烷基苯磺酸鈉(LAS)、吐溫-80、吐溫-20對黃芪黃酮得率的影響;在溴化十六烷基三甲胺添加量0．2%、乙醇濃度80%、提取溫度80℃、提取時間2h的條件下，考察酶添加量 0．1% 、0．2% 、0．3% 、0．4% 、0．5%對黃芪黃酮得率的影響;在溴化十六烷基三甲胺添加量0．2%、酶添加量0．2%、提取溫度80℃、提取時間2h的條件下，考察乙醇濃度 50%、60%、70%、80%、90%對黃芪黃酮得率的影響;在溴化十六烷基三甲胺添加量0．2%、酶添加量0．2%、乙醇濃度80%、提取時間2h的條件下，考察提取溫度50、60、70、80、90℃對黃芪黃酮得率的影響;在溴化十六烷基三甲胺添加量0．2%、酶添加量0．2%、乙醇濃度80%、提取溫度80℃的條件下，考察提取時間0．5、1．0、1．5、2．0、2．5h 對黃芪黃酮得率的影響。

1．2．5 響應(yīng)面分析與優(yōu)化設(shè)計 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，對影響黃酮得率較為明顯的提取溫度(A)、乙醇濃度(B)、溴化十六烷基三甲胺添加量(C)三個因素，采用Box-Behnken中心組合實驗，設(shè)計三因素三水平中心組合實驗，利用Design-Expert8．0軟件進行響應(yīng)面分析，建立多元二次回歸方程，確定黃芪黃酮的最佳提取工藝條件。

表1 三因素三水平中心組合實驗因素水平編碼表Table 1 Three factors and three levels of central composite experiment factor level table

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2．1．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照 1．2．1 方法，得到蘆丁濃度Y(mg/mL)與吸光度 X的回歸方程:Y=8．645X-0．003，相關(guān)系數(shù) R2=0．9993，蘆丁濃度在 0～0．048mg/mL范圍內(nèi)，吸光度與蘆丁濃度呈良好線性關(guān)系。

2．1．2 表面活性劑種類對黃酮得率的影響 由圖1可知，表面活性劑種類對黃芪黃酮得率有明顯影響，原因可能是不同表面活性劑對木質(zhì)纖維素中的木質(zhì)素的吸附作用力不同，阻止了酶與木質(zhì)素的無效結(jié)合，或是在溶液中形成不同的分子聚合體改變了黃酮的溶解性，其中溴化十六烷基三甲胺添加量在黃芪黃酮的提取過程中所起促進作用最明顯，因此，選擇溴化十六烷基三甲胺進行下一步實驗。

2．1．3 溴化十六烷基三甲胺添加量對黃酮得率的影響 由圖2可知，隨著溴化十六烷基三甲胺添加量的增加，黃酮得率隨之提高。在溴化十六烷基三甲胺添加量0．1%～0．3%時黃酮得率增加較明顯，隨后變化趨于平緩。結(jié)果表明，隨著溴化十六烷基三甲胺添加量增加，得率逐漸上升，并在0．4%～0．5%達(dá)到平衡，因此，選擇溴化十六烷基三甲胺添加量為0．4% 為宜。

2．1．4 酶添加量對黃酮得率的影響 由圖3可以看出，隨著纖維素酶添加量的增加，黃酮得率略有上升。在酶添加量為0．2%時，黃酮得率達(dá)到較大值(3．981%)，之后繼續(xù)加大酶添加量，得率提高不顯著，考慮提取成本問題，選擇纖維素酶添加量0．2%為宜。

圖2 溴化十六烷基三甲胺添加量對黃酮得率的影響Fig．2 Effects of surfactant addition on the yield of flavonoids

圖3 酶添加量對黃酮得率的影響Fig．3 Effects of enzyme addition on the yield of flavonoids

2．1．5 提取溫度對黃酮得率的影響 由圖4可以看出，提取溫度對黃芪黃酮得率有明顯影響。在一定范圍內(nèi)，黃酮得率隨提取溫度的增大而先增加后降低。在提取溫度為80℃時，黃酮得率達(dá)到最高值(4．127%)，之后得率略有降低。原因可能是過高的溫度使黃酮分解，從而使黃酮得率降低。因此，提取溫度選取80℃為宜。

圖4 提取溫度對黃酮得率的影響Fig．4 Effect of extracting temperature on the yield of flavonoids

2．1．6 提取時間對黃酮得率的影響 由圖5可以看出，提取時間對黃酮得率有明顯影響，隨著提取時間的延長，黃酮得率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，2h時黃酮得率達(dá)到最高點(4．172%)。提取的傳質(zhì)過程，需要一定時間才能達(dá)到平衡，時間太短，還未達(dá)到平衡，黃酮得率偏低;當(dāng)傳質(zhì)過程達(dá)到基本平衡后，隨著提取時間的延長，可能導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)熱分解損失。因此，提取時間選擇2h為宜。

圖5 提取時間對黃酮得率的影響Fig．5 Effect of extracting time on the yield of flavonoids

2．1．7 乙醇濃度對黃酮得率的影響 由圖6可以看出，隨著乙醇濃度的增大，黃芪黃酮得率逐漸升高，乙醇濃度為80%時，黃酮得率達(dá)最大，但當(dāng)乙醇濃度超過80%時，得率有所下降，這說明乙醇濃度較低時不利于黃酮類物質(zhì)的溶出，而乙醇濃度過大時，蛋白質(zhì)，糖類等大分子會發(fā)生凝聚，阻塞內(nèi)部組織的孔道，使黃酮類化合物擴散的阻力增加。因此確定乙醇溶液的適宜濃度為80%。

圖6 乙醇濃度對黃酮得率的影響Fig．6 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoids

2.2 回歸模型的建立與分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，利用Box-Behnken中心組合實驗的設(shè)計原理［14］，設(shè)計了乙醇濃度、提取溫度、溴化十六烷基三甲胺添加量三因素三水平共15個實驗點的響應(yīng)分析實驗。

利用Design-Expert8．0軟件進行乙醇濃度、提取溫度、溴化十六烷基三甲胺添加量三個因素對黃芪黃酮得率的回歸分析，建立三元二次回歸方程:

Y=4．26+0．08A+0．033B-5．00E-003C+0．08AB+0．13AC+0．095BC-0．19A2-0．29B2-0．21C2(R2=0．9779)

運用Design Expert8．0軟件對15個實驗點的響應(yīng)值進行方差分析，見表3。

由表3可以看出，回歸模型是極顯著的(p=0．0001 ＜0．01)，同時該模型具有較高的相關(guān)系數(shù)(R2=0．9779)，擬合度大于97%。說明該模型能夠反映響應(yīng)值的變化，而且方程的失擬項很小，說明該方程對試驗擬合情況好、誤差小，因此可以用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進行分析和預(yù)測。

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis for regression equation

表2 三因素三水平中心組合實驗方案與結(jié)果Table 2 Three factors and three levels of central composite experiment factor level table

2.3 響應(yīng)面實驗交互因素分析

通過Design Expert 8．0軟件分析，將三因素兩兩進行分析比較，做出響應(yīng)面曲線圖。由圖7～圖9可以看出，溫度相較于乙醇濃度、溴化十六烷基三甲胺添加量的曲線較陡峭，說明溫度對于黃酮提取的影響較顯著些;溫度固定時，乙醇濃度的曲線比溴化十六烷基三甲胺添加量的陡峭，再一次驗證了黃芪黃酮提取過程中，乙醇濃度的影響比溴化十六烷基三甲胺添加量的大。

圖7 提取溫度與乙醇濃度對黃酮得率影響Fig．7 Interaction effects of extracting temperature and ethanol concentration on the yield of flavonoids

圖8 乙醇濃度與溴化十六烷基三甲胺添加量對黃酮得率影響Fig．8 Interaction effects of ethanol concentration and CTMAB addition on the yield of flavonoids

等高線即為響應(yīng)面圖在底面的投影，其形狀反映了交互影響的強弱大小。等高線趨于圓形時，兩因素的交互作用相對較弱;等高線呈橢圓形時，兩因素的交互作用相對較強［15］。由圖可知，乙醇濃度和溴化十六烷基三甲胺添加量等高線趨于圓形，說明在某一因素取最佳值，其他兩因子的交互作用為差異顯著。乙醇濃度和提取溫度的等高線、提取溫度和溴化十六烷基三甲胺添加量等高線為橢圓形，說明這兩組因素的交互作用顯著。

圖9 提取溫度與溴化十六烷基三甲胺添加量對黃酮得率影響Fig．9 Interaction effects of extracting temperature and CTMAB addition on the yield of flavonoids

由回歸方程可知，表面活性劑輔助酶解提取黃芪黃酮最優(yōu)工藝條件為:提取溫度78．87℃，乙醇濃度79．73%，溴化十六烷基三甲胺添加量0．37%，在該條件下，黃芪黃酮的得率的理論值達(dá)4．287%。考慮到實際操作情況，將表面活性劑輔助酶解提取黃芪黃酮工藝條件優(yōu)化為提取溫度79℃，乙醇濃度80%，溴化十六烷基三甲胺添加量為0．37%。在此工藝條件下，進行3次驗證實驗，黃芪黃酮的平均得率為4．192%。

3 結(jié)論與討論

3.1 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù) Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，設(shè)計三因素三水平實驗，利用Design-Expert8．0軟件進行響應(yīng)面分析，建立了黃芪黃酮提取的三元二次回歸方程，經(jīng)檢驗該回歸方程是合理可靠的，能夠較好的預(yù)測黃芪黃酮的得率。優(yōu)化得出黃芪黃酮的最佳提取工藝條件為溴化十六烷基三甲胺添加量0．37%，乙醇濃度80%，提取溫度79℃，在此條件下黃酮得率實測值可達(dá) 4．192%，與理論值(4．287%)基本吻合，充分驗證了該模型的可靠性。

3.2 本文采用表面活性劑輔助酶法預(yù)處理提取法，該方法目前尚無文獻(xiàn)報道，可以拓展為一種中藥有效成分提取的新方法。與傳統(tǒng)提取方法相比，具有選擇性高、能耗低、排污量少等優(yōu)點，與閃式提取法、超聲波提取法相比，適用面更廣，且設(shè)備簡單，有效成分得率顯著提高，符合當(dāng)今綠色化學(xué)的潮流，對黃芪的進一步開發(fā)利用具有重要現(xiàn)實意義。

3.3 本文將表面活性劑輔助酶法預(yù)處理與有機溶劑提取相結(jié)合，提高了酶的水解效率，最大程度地釋放有效成分。另外，由于表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)具有兩親性，可降低物質(zhì)之間的界面張力，使溶劑分子更易滲入顆粒中，從而提高有效成分的提取效率。但該方法還處于實驗室研究階段，還未應(yīng)用于實際生產(chǎn)中，在以后的工作中需要對表面活性劑的殘留問題以及產(chǎn)物的安全性進行深入的研究。

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