脈沖強光對鹽脅迫下發芽糙米積累γ-氨基丁酸工藝條件優化

劉利霞，趙 旭，王 勃，劉 賀，惠麗娟，何余堂，馬 濤，*

(1．沈陽農業大學食品學院，遼寧沈陽110866;2．遼寧省糧食科學研究所，遼寧沈陽110866;3．渤海大學化學化工與食品安全學院，遼寧錦州121013)

稻谷脫殼即為糙米，糙米經過適宜的發芽，富含纖維的皮層被部分酶解發生組織軟化，其吸水性和膨脹性改善，食用品質提高。研究表明，糙米發芽之后大量生理活性成分增加，其中γ-氨基丁酸的含量是發芽前的5倍［1］，γ-氨基丁酸是一種廣泛分布在動植物體內的非蛋白質氨基酸，通常被認為有改善健康的效果［2］，具有降低血壓、促進睡眠，增強記憶力、預防與治療癲癇、解毒等功效［3］。因此，提高發芽糙米GABA含量的研究引起國內外研究者們的廣泛關注。

脈沖強光技術主要是作為一種非熱殺菌技術應用在食品原料的處理中。目前，脈沖強光技術在食品中的應用研究多集中于固體食品的表面殺菌，主要研究有糧油制品［4］、果蔬［5］、奶制品［6］等殺菌方面。Uesugi和Moraru［7］的研究表明脈沖強光能顯著降低香腸中單細胞增生李斯特菌的數量。Oms-Oliu和Aguiló-Aguayo［8］等人研究了脈沖強光處理對鮮切蘑菇質量和抗氧化性質的影響;馬鳳鳴［9］研究了脈沖強光對梨多酚氧化酶的影響;馬濤［13］采用脈沖強光制備發芽糙米的方法發明專利說明脈沖強光對制備發芽糙米有一定的促進作用。植物原料經過脈沖疝氣燈管閃照后其細胞受損［10］，提高酶的活性。糙米的發芽實質是一個酶解的過程，糙米在發芽過程中，內源的谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)被激活，將糙米中的谷氨酸轉化為GABA，從而顯著地提高GABA的含量，而GAD活性又受谷氨酸濃度等因素的影響［11］;植物受到低氧、缺氧、冷激、熱激、鹽脅迫以及機械刺激等逆境脅迫時，植物體內GABA含量明顯升高，機械刺激引起GABA積累的可能途徑是植物細胞內H+濃度的增加，進而激發GAD活性，導致GABA的積累;鹽脅迫逆境處理引起GABA積累的途徑是Ca2+濃度的提高，進而促進內源酶谷氨酸脫羧酶的活性的提高［12］。對發芽糙米進行適宜的脈沖強光處理能夠促進GABA積累［13-14］。這種現象與植物受到低氧、缺氧、冷激、熱激、鹽脅迫以及機械刺激等逆境脅迫時，植物體內GABA成倍增加非常相似。因此，本實驗對鹽脅迫下的發芽糙米進行脈沖強光處理，研究發芽糙米積累GABA的變化規律，為生產高含量GABA的健康食品原料及開辟脈沖強光應用新領域奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糙米 鞍山市熙祥食品有限公司;γ-氨基丁酸(GABA)標品(純度＞99%)Sigma公司;谷氨酸鈉(味精，谷氨酸鈉＞99% 無鹽)北京市朝陽區中聯化工試劑廠;甲醇，色譜純 Merck KGaA Darmstadt Germany;鄰苯二甲醛(OPA，化學純)國藥集團化學試劑有限公司;β-巰基乙醇(純度＞99%) 天津市致遠化學試劑有限公司;次氯酸鈉，分析純，有效氯為9%天津市致遠化學試劑有限公司;硼酸，分析純 國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇，分析純 國藥集團化學試劑有限公司;乙酸鈉，分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

ZWB-I-01(LA50-800H)脈沖強光表面殺菌實驗柜 寧波中物光電殺菌技術有限公司;Agilent-1200高效液相色譜儀 美國Agilent公司;HH-601A超級恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市醫療儀器廠;HPX-9082ME型電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;DHG-9055A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;RRH-A500型高速多功能粉碎機 上海緣沃工貿有限公司;SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;SK6210HP超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限公司;0．45μm微孔濾膜(有機系) 上海興亞凈化材料廠;SC-279GA海爾冰柜 海爾公司。

1.2 實驗方法

1．2．1 發芽糙米的制備 精選顆粒飽滿、胚芽保留完整的為原料，先用蒸餾水清洗3遍，然后用1%的次氯酸鈉溶液浸泡5min(加入量以剛好淹沒糙米為宜)，消毒之后用清水清洗3遍，蒸餾水清洗3遍，于30℃水浴鍋中浸泡12h，28℃恒溫培養箱中培養發芽，發芽結束后將培養皿放入55℃烘箱終止活性［15］，干燥至5h，于4℃冰箱保存備用。

1．2．2 脈沖強光處理 打開脈沖強光實驗柜，運行10min后儀器保持穩定啟動，根據蔣靜等［14］研究設置實驗脈沖參數，脈沖強光能量300J，脈沖距離11cm，脈沖頻次為1次/s，將浸泡好的糙米放在培養皿中，每份8g，然后將培養皿放在無菌的石英板的中央，關上柜門，開始不同實驗參數的脈沖強光處理，每隔5min處理一次。

1．2．3 發芽糙米GABA提取 將發芽糙米樣品干燥粉碎，過60目篩，于雙層密封袋4℃保存，準確稱取2．5g發芽糙米樣品，加適量蒸餾水研磨勻漿，然后定容至25mL于70℃水浴鍋中浸提2h，水浴后3000r/min離心分離，然后取上清液待測［16］。

1．2．4 GABA 含量的測定

1．2．4．1 HPLC 色譜條件 色譜柱:AgilentTC-C18色譜柱(4．6mm × 250mm，5μm)，柱溫 35℃，流動相:0．05mol/L CH3COONa·3H2O(pH6．8)，500mL;甲醇300mL;進樣量10μL，流速 1mL/min，單泵，紫外檢測波長248nm。

1．2．4．2 衍生試劑的配制 準確稱取10mg鄰苯二甲醛(OPA)，與10mL甲醇溶液充分溶解后轉移至50mL棕色容量瓶中，然后加0．05mL β-巰基乙醇和2mL，pH9．5的硼酸緩沖液，最后用超純水定容至50mL，4℃保存備用。

1．2．4．3 樣品GABA的檢測 將發芽糙米樣品干燥粉碎，過60目篩，于雙層密封袋4℃保存，準確稱取2．5g發芽糙米樣品，與60℃水浴中浸提2h，水浴后4000r/min離心20min，取上清液0．5mL，加 OPA 衍生試劑0．5mL進行柱前衍生3min，之后立即過膜，進樣檢測［17］。

1．2．4．4 GABA標準曲線的繪制 準確稱取 GABA標準品500mg，用超純水溶解并定容于50mL的容量瓶中，振蕩搖勻，配制成10mg/mL的標準溶液，然后再用上述標準溶液分別稀釋至 0．05、0．1、0．15、0．2、0．25mg/mL系列濃度的標準溶液，以OPA為柱前衍生試劑衍生3min后進樣檢測，以相應質量濃度標準液為橫坐標(mg/mL)，以γ-氨基丁酸色譜峰面積為縱坐標(mAU)，繪制標準曲線。

1．2．5 單因素實驗方法 本實驗過程中研究谷氨酸鈉濃度、脈沖時間和發芽時間三個因素對發芽糙米GABA含量的影響，每次實驗重復3次。

1．2．5．1 谷氨酸鈉濃度單因素實驗 取6份糙米，每份 10g，分別用 80mL，濃度為 0、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0(mg/mL)的谷氨酸鈉溶液于30℃恒溫水浴鍋內浸泡12h，然后放入培養箱內發芽，滅酶干燥得到發芽糙米，測定其GABA含量，重復3次。

1．2．5．2 脈沖時間單因素實驗 糙米浸泡后，將糙米鋪在墊有濾紙的培養皿中，在脈沖單次能量為300J、脈沖距離為11cm、脈沖頻次1次/s的條件下分別照射 10、20、30、40、50s，然后放入培養箱內發芽，滅酶干燥得到發芽糙米，以無脈沖強光處理為對照組，測定其GABA含量，重復3次。

1．2．5．3 發芽時間單因素實驗 糙米浸泡后，進行脈沖處理，然后放入培養箱內分別發芽16、20、24、28、32、36h，滅酶干燥得到發芽糙米，以無發芽處理為對照組，測定其GABA含量，重復3次。

1．2．6 實驗條件優化 根據單因素實驗結果，以谷氨酸鈉濃度、脈沖處理時間以及發芽時間為單因素，發芽糙米中GABA積累含量為響應值設計響應面實驗，優化糙米發芽工藝，根據Box-Behnken的中心組合設計原理［18］，通過 Design-Expert8．0 軟件對實驗數據進行分析，各因素及水平編碼如表1所示。

表1 Box-Behnken實驗因素及水平Table 1 Experiment factors and their levels for Box-Behnken design

1.3 最佳發芽條件的驗證

根據實驗的優化結果，運用Design-Expert8．0得出回歸方程，以積累發芽糙米GABA最優含量為響應值，得出發芽糙米GABA工藝參數和理論含量，將得出的工藝參數修正以便于操作后，進行驗證實驗，用來評價工藝參數的可靠性。

1.4 數據分析

運用 Design-Expert軟件(Version 8．0．6)對響應面實驗所得數據進行線性回歸和方差分析，模型和因素的顯著性以F值進行考察(p＜0．05)，所有實驗均重復3次，以干基表示結果。

2 結果與討論

2.1 GABA高效液相色譜檢測圖

利用柱前衍生高效液相色譜法測定GABA標準品和發芽糙米樣品的譜圖如圖1和圖2所示，在1．2．4．1色譜條件下，在 AgilentTC-C18色譜柱上對衍生的標樣和實際發芽糙米樣品組分進行了有效的分離，標準品中γ-氨基丁酸的保留時間為5．846min，發芽糙米樣品中γ-氨基丁酸的保留時間為5．976min，實際發芽糙米樣品中其他共存氨基酸和雜質不干擾目標物的測定，GABA與其他氨基酸衍生物分離比較完全，其他雜質對測定基本沒有干擾。

圖1 GABA標準品色譜圖Fig．1 Chromatogram ofγ-aminobutyric acid standard

2.2 GABA標準曲線

得到的GABA標準曲線的回歸方程為y=54744x+8070．3，R2=0．9988。

2.3 單因素實驗結果

2．3．1 鹽濃度對發芽糙米GABA含量的影響 由圖4可知，隨著谷氨酸鈉濃度的增加，GABA含量先呈現上升趨勢，當谷氨酸鈉濃度達到2．0mg/mL時，GABA含量達到最高，之后呈現下降趨勢，原因可能是隨著谷氨酸鈉濃度的增加，谷氨酸脫羧酶可利用的底物逐漸增多，過高濃度的谷氨酸鈉溶液會抑制GABA 的生成［19］。

圖2 發芽糙米色譜圖Fig．2 Chromatogram of the germinated brown rice powder sample

圖3 γ-氨基丁酸的標準曲線Fig．3 Standard curve of γ-aminobutyric acid

圖4 谷氨酸鈉濃度對GABA含量的影響Fig．4 Effect of Sodium glutamate concentrationon the GABA content

2．3．2 脈沖時間對發芽糙米GABA含量的影響 由圖5可知，當脈沖閃照時間為30s時，發芽糙米GABA含量達到最大，之后隨著脈沖閃照時間的延長，GABA含量呈下降趨勢，原因可能是隨著脈沖閃照時間的延長，酶活性下降，加速了酶蛋白的分解，進而影響糙米的發芽。當脈沖處理達到30s時，脈沖能量改變了蛋白酶和谷氨酸脫羧酶的活性，蛋白酶水解儲存性蛋白質，成為水溶性的氨基酸GABA。

2．3．3 發芽時間對發芽糙米GABA含量的影響 由圖6可知，在糙米發芽的過程中，隨著發芽時間的延長，GABA含量呈現先增長后下降的趨勢，發芽到28h含量達到最大值，隨著發芽培養時間的繼續延長，GABA含量逐漸降低，原因可能是在較長時間的發芽過程中，GABA在轉氨酶的作用下，轉換成琥珀酸半醛，使得 GABA含量開始下降［20］，本實驗條件下，發芽時間為28h較為適宜。

圖5 脈沖時間對GABA含量的影響Fig．5 Effect of Pulsed light flash time on the GABA content

圖6 發芽時間對GABA含量的影響Fig．6 Effect of germination time on the GABA content

2.4 響應面分析法優化糙米發芽條件結果分析

2．4．1 實驗因素水平編碼與實驗結果 采用RSM軟件進行Box-Behnken中心組合實驗設計，依次進行浸泡培養發芽，以發芽糙米中GABA含量為響應值(Y)進行響應面實驗，實驗設計及結果如表2所示。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Test design and results of Box-Behnken design

2．4．2 二次多項式回歸模型建立與顯著性檢驗 由于各因素對發芽糙米積累GABA影響不是簡單的線性關系，為了更好說明各因素對響應值的影響，根據回歸方程繪制響應面分析圖［15］，采用Design-Expert 8．0軟件對二次回歸模型進行分析，擬合后得到關于谷氨酸鈉濃度(A)、脈沖時間(B)、發芽時間(C)二次多項回歸方程:

Y=180．82+2．38A+6．23B-2．05C-7．83AB+9．68AC+8．43BC-25．32A2-16．17B2-5．32C2

由表3可知，整體模型極為顯著(“Pr＞F”值＜0．0001)，失擬項不顯著(p ＞0．05)，說明該模型在統計學上有意義并對實驗擬合較好，說明該模型能夠解釋99．14%響應值的變化，同時說明了GABA含量隨著發芽條件的變化，因素B(脈沖時間)對響應值影響極顯著(p＜0．0001)，且交互項AB(p＜0．0001)、AC(p ＜ 0．05)、BC(p ＜ 0．05)的交互作用對發芽糙米富集GABA影響顯著，綜上所知，各個因素對響應值的影響程度為:B(脈沖時間)＞A(谷氨酸鈉濃度)＞C(發芽時間)。

表3 回歸方程的統計分析Table 3 Statistical analysis of regression equation

2．4．3 響應面水平的優化 回歸方程中影響顯著的交互項所做的響應面曲線圖如圖7～圖9所示。根據回歸方程繪制響應面分析圖，運用Design-Expert 8．0軟件對模型進行分析，尋求發芽糙米積累GABA最大值的穩定點及對應的因素水平，由圖7～圖9最高穩定點和等高線面圖可知，回歸模型存在穩定點，穩定點即極大值點，結合二次多項式的回歸方程進行模型的統計分析，對回歸模型求一階偏導，得出各個因素的最佳條件參數是 A=2．01，B=31．80，C=27．84，即谷氨酸鈉濃度為 2．01mg/mL，脈沖時間為31．80s，發芽時間為 27．84h，在此參數條件下，發芽糙米中GABA含量達182．6mg/100g。

圖7 Y=f(A，B)響應面圖Fig．7 Response surface of the effects of A and B on the content of γ-aminobutyric acid

圖8 Y=f(A，C)響應面圖Fig．8 Response surface of the effects of A and C on the content of γ-aminobutyric acid

2.5 驗證實驗

對最佳工藝條件進行驗證實驗，重復實驗5次，得到脈沖強光處理鹽脅迫下發芽糙米GABA含量實測值為181．5mg/100g，與理論值接近，說明通過響應面優化后得出的工藝參數具有一定得實踐指導意義，因此，可用此模型預測并指導生產實際。

3 結論

圖9 Y=f(B，C)響應面圖Fig．9 Response surface of the effects of B and C on the content of γ-aminobutyric acid

根據單因素以及Box-Behnken響應面實驗，建立發芽糙米積累GABA影響因素的二次回歸模型，該模型回歸顯著，實驗擬合誤差小，具有一定的實際指導價值，并得到脈沖強光對鹽脅迫下發芽糙米積累GABA最佳工藝條件:谷氨酸鈉濃度2．01mg/mL，脈沖時間 31．80s及發芽時間 27．84h，驗證值與預測值接近，因此說明響應面法優化鹽脅迫下對發芽糙米實施脈沖強光處理積累GABA參數的可行性，可為今后實際生產和評價發芽糙米富集GABA含量提供理論依據。

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