熒光增強型量子點探針檢測痕量谷氨酸脫氫酶

楊敏+余濤+張忠平+王素華+蔣輝

摘 要 建立了熒光增強型量子點探針檢測痕量谷氨酸脫氫酶（GLDH）的方法， GLDH是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的酶分子，具有氧化性的NAD+通過電子轉移淬滅CdTe量子點的熒光，而GLDH催化的生物化學反應可以消耗NAD+。 在所采用的NAD+/GLDH體系中，量子點的熒光先被NAD+淬滅，加入GLDH消耗NAD+，熒光會因NAD+的減少而增強。利用這種高選擇性的酶促反應可以檢測濃度范圍比較寬的GLDH（10～1000 U/L）。對于這個濃度范圍GLDH的檢測在臨床上有重要意義，可用于診斷不同類型的肝臟疾病。

關鍵詞 熒光分析法； 量子點； 谷氨酸脫氫酶； NAD； 肝損傷

1 引 言

基于半導體納米顆粒的量子點因其獨特的電子性質和光學特性已被用于許多領域的研究中[1，2]，其具有較寬的吸收光譜、較窄的發射譜帶和抗光漂白特性。這些優點使其適用于生物學的研究，例如體外成像[3～7]、體內跟蹤[8，9]，生物分析[9]和生物傳感器的研究[10，11]。 近年來，已有多種基于熒光分子探針和量子點的生物傳感器用于不同分析物的檢測，如檢測金屬離子（Ag+， Cu2+， Pb2+）、活性小分子（NO和HClO）、生物活性大分子（DNA、蛋白質、酶）等[12～19]。

本研究利用CdTe量子點檢測谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase， GLDH）。GLDH是線粒體酶，存在于所有組織的細胞中，其中以肝臟細胞線粒體內的GLDH活性最高，當肝細胞發生損害時，GLDH會進入血液，因此臨床上通過測定血清GLDH的含量作為診斷肝細胞損傷病變的指標分子[20]。同其它用于診斷肝疾病的標記分子，如ALT， AST， SDH， ALP[21，22]相比，GLDH的特異性更高，肝細胞發生損傷時GLDH上升量更多，因此對肝細胞損傷的診斷更為靈敏[23]。現有的用于檢測GLDH的方法有比色法、分光光度法及酶聯免疫吸附法（ELISA）。這些方法存在靈敏度低、假陽性等缺陷。基于增強型熒光體系的分析方法主要基于熒光共振能量轉移和光誘導電子轉移兩種機理，其靈敏度高、干擾少，因此是檢測多肽和酶等生物分子的有效技術[24]。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Perkin Elmer LS 55熒光光譜儀測定（美國PE公司）。Shimadzu UV 2550光譜儀（日本島津公司）。

3 巰基丙酸（3 Mercaptopropionic acid， MPA）和谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase， GLDH，type II）購自Sigma公司；碲粉（Tellurium）、L谷氨酸（Lglutamate）、NaHB4、CdCl2·2.5H2O（國藥集團化學公司）。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide， NAD+，上海生工有限公司）。所有試劑都是分析純，未經純化直接使用。超純水（18.2 MΩ

SymbolWC@ cm）來自于Millipore純水系統（美國Millipore公司）。

2.2 實驗方法

MPA CdTe量子點是通過對文獻＼[25] 的方法改進合成得到的。將0.0319 g碲粉和0.05 g NaHB4加入到通N2保護的超純水中，形成黑色的混合液，混合液在冰浴中攪拌直至液體澄清；將0.2284 g CdCl2·2.5H2O和0.21 mL 3 巰基丙酸（MPA）溶解在超純水中，用NaOH將溶液調至pH=9，溶液通入N2除O2；向碲粉和NaHB4的混合液中加入適量0.5 mol/L H2SO4，產生白色的H2Te氣體，將H2Te氣體通入到CdCl2

SymbolWC@ 溶液中，攪拌20 min，通過控制回流時間可以得到不同尺寸的CdTe量子點。回流約1 h就得到綠色的CdTe量子點。制備好的量子點用丙酮進行純化。

檢測過程如下： 首先將8 μL 綠色量子點溶解在2 mL超純水中，混勻后測量其熒光強度，記錄為I0。加入不同濃度的NAD+（0～14.71 μmol/L）， 10 min后，測量混合液的熒光強度，記錄為I， 從而得到量子點熒光強度猝滅不同百分比所需要的NAD+濃度。GLDH的檢測順序：根據前面的實驗結論，確定輔因子NAD+的固定用量，并與相同量的底物L谷氨酸混合，再加入不同量的GLDH，在25 ℃水浴下反應10 min。 將反應混合液分別加入到CdTe量子點溶液中，5 min后測量熒光強度，記錄為Ij （j表示谷氨酸脫氫酶（GLDH）的濃度，j=0， 10， 25， 50， 100， 250， 500， 750和1000 U/L）。所有的熒光光譜都用400 nm波長激發，掃描范圍為450～650 nm，掃描速度為500 nm/min。

3 結果與討論

3.1 NAD+對MPA CdTe量子點熒光的淬滅

NAD+可以通過電子轉移途徑有效淬滅量子點的熒光。NAD+對量子點熒光的淬滅隨著時間的變化關系見圖1。NAD+的加入會引起CdTe量子點的熒光強度的降低，隨著作用時間的增長，量子點的熒光強度也會逐漸減弱。10 min后，量子點的熒光強度會達到一個穩定值。不同濃度的NAD+引起的CdTe量子點熒光強度的變化見圖2，量子點的熒光強度隨著NAD+的濃度的增加而降低。圖中的插圖為量子點熒光強度的比值I/I0（I是加入NAD+后量子點的熒光強度，I0是量子點的初始熒光值）與NAD+濃度關系的標準曲線。從上述實驗結果可以看出，NAD+可以淬滅MPA CdTe的熒光，基于這個現象，可以采用量子點來檢測GLDH。

3.2 熒光檢測GLDH

GLDH以NAD+為輔酶，在體內催化谷氨酸生成α酮戊二酸的反應及其逆反應。將GLDH與L谷氨酸加入到含有NAD+的溶液中，NAD+會隨著反應的進行而被消耗，氧化態的NAD+轉變為還原態的NADH。如體系中預先加入了CdTe量子點，NAD+的減少會使之前被NAD+淬滅的CdTe量子點的熒光增強。基于此，設計了一種光學檢測體系用于GLDH的檢測。圖3為量子點檢測GLDH的實驗原理。研究表明，NAD+在磷酸鹽緩沖體系中不能發揮其淬滅CdTe量子點熒光的作用。圖4是以pH 7.2的磷酸鹽緩沖液作為溶劑，NAD+對CdTe量子點熒光的淬滅。從圖4可見，CdTe量子點的熒光強度基本不發生變化。為了證明NAD+在磷酸鹽緩沖液中是否發生分解，從而影響其對量子點熒光的淬滅作用，對比了分別用超純水和磷酸鹽緩沖液作為溶劑時NAD+的紫外 可見吸收光譜。圖5中實線為NAD+在超純水中的吸收譜圖，虛線為NAD+在磷酸鹽緩沖液中的吸收譜圖。兩條線是重合的，由此得出，NAD+在磷酸鹽緩沖液中并沒有發生分解。

為了解決上述問題，設計了兩步法，將酶催化反應和熒光檢測過程分別進行。第一步是GLDH酶的催化反應，將底物L谷氨酸、輔因子NAD+，及不同量的GLDH混合在PCR管中反應；第二步是將上述混合物分別加入到含有CdTe量子點的溶液中，混合5 min后，記錄量子點的熒光強度為Ij，量子點的初始熒光值被記錄為Ii（i，j= 0，10， 25， 50， 100， 250， 500， 750和1000 U/L）。圖6展示了不同的GLDH對CdTe量子點熒光強度的恢復情況。在低濃度的GLDH時，因為只有少量NAD+會因為GLDH的酶催化反應被消耗，所以量子點熒光增強的程度很微弱。隨著GLDH的增加，NAD+的量大大減少，量子點的熒光逐步恢復到初始強度。圖6插圖是反應產物加入前后量子點熒光強度的比值同GLDH濃度的關系。本實驗檢測的GLDH濃度范圍為10～1000 U/L，這個區間在醫學診斷上有重要的應用，可以根據GLDH濃度區分不同類型的肝損疾病。

從圖6可見，隨著GLDH濃度增加，量子點的熒光強度增強，而且超出了初始值。實驗表明，GLDH本身也可以增強量子點的熒光，如圖7所示。單獨加入100 U/L GLDH會增加CdTe量子點的熒光強度，增強幅度接近2倍（I/I0=2，I0和I分別為加入GLDH前后的量子點熒光值）。而在酶促反應體系中，加入100 U/L GLDH、NAD+、谷氨酸，得到的I/I0=0.96，只約為單獨GLDH增強作用1/2。這說明GLDH優先與NAD+發生反應，導致被NAD+猝滅的量子點熒光得到大部分的恢復，但低濃度的GLDH酶表現出明顯的熒光增強作用。在酶促反應檢測體系中，GLDH主要用于催化谷氨酸的脫氨反應而消耗NAD+，繼續增加GLDH的含量，直至NAD+被反應消耗完全，酶催化反應結束，多余的GLDH進一步增強量子點的熒光，在采用高濃度的GLDH時，其熒光增強作用表現的比較明顯，這與本實驗現象吻合。

采用NAD+/GLDH體系，將量子點的獨特的光學特性和酶的特異性、高效性相結合，實現了對GLDH簡單、快速的檢測。GLDH作為肝損傷的重要指標分子，在診斷不同的肝臟疾病中有重要的應用。本檢測方法可以實現對GLDH較大濃度區間（10～1000 U/L）的測定，在臨床中有潛在的應用價值。

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