激光剝蝕 電感耦合等離子體質譜法原位分析印度芥菜中Cd、P、S、Cu等7種元素

楊紅霞+趙令浩+高津旭+劉崴+李冰??

摘 要 建立了莖中7種元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的LA ICP MS原位分析及二維成像方法，并研究了其在鎘富集型印度芥菜莖中的分布特征。印度芥菜經50

SymbolmA@ mol/L Cd處理14 d后，利用包埋劑包埋，冷凍切片后，用Nd：YAG laser（213 nm）器掃描，激光剝蝕 電感耦合等離子體質譜法（ICP MS）測定各元素強度，同時選擇13C作為內標元素，對各元素強度進行標準化處理。結果表明，在富集型印度芥菜莖部，Cd大量積聚于由韌皮部與木質部組成的維管組織中，除此以外，莖的韌皮部細胞中及表皮層也分布著大量的Cd。7種元素的分布相關性表明，Cd與Ca具有相似的分布規律，而K和Ca， P和S的分布呈顯著正相關。說明重金屬元素進入植株體內并被其吸收運輸過程是伴隨著植物對其它元素的吸收，且具有相似的運輸機制。本研究建立的元素原位分析方法證明LA ICP MS在植物樣品中元素空間分布的研究方面具有很大的潛力。

關鍵詞 激光剝蝕 電感耦合等離子體質譜法； 印度芥菜； 原位分析； 鎘； 磷

1 引 言

近年來，研究重金屬在植物細胞中的微區分布漸漸成為探索植物耐性機理的熱點，基于同步輻射微區XRF是原位分析Cd的有力工具，Isaure等[1]利用SRXRF分析生長在Cd 污染土壤的Arabidopsis thaliana葉片，發現Cd主要分布在葉片的毛狀體。Fukuda等[2]在Cd超積累植物Arabidopsis halleri的葉片同樣發現Cd 也分布在毛狀體上，并且Zn和Mn的分布與Cd相似。但Küpper等[3]利用SEM EDX研究卻發現Cd主要分布在Arabidopsis halleri的葉肉細胞。近年來也有研究將LA ICPMS應用于生物樣品的測試的報道，盡管具有缺乏植物激光固體標準校準物質，而使用其它固體標樣時，可能由于基體效應而影響測試結果，但當只需相對定量數據以便比較樣品中不同元素分布情況時，激光剝蝕 電感耦合等離子體質譜法（LA ICP MS）被證明是一種有效的半定量分析方法[4～10]。Tian等[11]利用LA ICPMS技術結合熒光探針染色技術對超積累東南景天（HE）葉中Cd等元素的分布特征進行原位分析。結果表明，Cd在維管組織和上皮層較高，而下表皮的分布相對較低；Zn主要分布在上下表皮細胞中。

理想的樣品無損處理技術應能利用最小的樣品量對污染物暴露情況進行準確且有代表性評價[12]，將LA ICPMS應用于生物介質中微量元素分析具有很大潛力，目前在該領域中的應用多集中于環形生長結構， 如樹環[13]、軟體動物殼[14，15]和魚耳石[16]。本研究采用LA ICPMS建立了莖中7種元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的原位微區分析及二維成像方法，并研究了其在Cd富集型印度芥菜莖中的分布特征。從細胞水平上揭示超積累植物中Cd 的轉運和富集規律。

2 實驗部分

2.1 儀器條件與參數

LA ICP MS分析采用Element II高分辨率質譜（ThermoFisher公司）及UP213 Nd：YAG深紫外激光燒蝕系統（New Wave），采用NIST612進行儀器調節，氧化物產率（232Th16O+/232Th+）低于0.3%，有效降低氧化物對待測元素的干擾，激光剝蝕采用線掃方式，行與行的間隔為10

SymbolmA@ m。具體工作參數見表1。

2.2 植物培養

植物材料為富集型印度芥菜，印度芥菜種子（426308）由美國農業部種子資源庫提供，種子進萌發后，播種于基質中，在基質中生長20 d，轉移到1/4營養液預培養8 d，再采用全營養液培養。營養液組成為：Ca（NO3）2 2.00 mmol/L，KH2PO4 0.10 mmol/L，MgSO4 0.50 mmol/L，KCl 0.10 mmol/L，K2SO4 0.70 mmol/L， H3BO3 10.00 μmol/L，MnSO4 0.50 μmol/L，ZnSO4 1.0 μmol/L，CuSO4 0.20 μmol/L，（NH4）6Mo7O24 0.01 μmol/L，Fe EDTA 100 μmol/L。每天用0.1 mol/L HCl 或者0.1 mol/L NaOH 調營養液至pH≈5.8，保持全天候通氣，每3 d換一次營養液。植物在溫室自然光條件下培養，日夜溫度分別為26/20 oC，濕度為70%/85%。在全營養液中培養8 d后，進行Cd處理，共設2個處理水平： ①CK（完全營養液），②25

2.3 樣品處理

取預培養10 d后的印度芥菜苗，添加25 μmol/L Cd處理，每個處理重復3次。Cd處理14 d后，切下植株的成熟葉片，用液氮固定，利用包埋劑包埋好后，在

Symbolm@@ 30 ℃的環境下利用冷凍切片機制成切片（60 μm厚）。 在30 ℃條件下冷凍干燥3 d。取出干燥后的樣品，在顯微鏡下拍照。

2.4 數據處理

采用Origin 8.1軟件進行數據處理及相關統計分析。

3 結果與分析

3.1 內標元素

為了補償激光剝蝕進樣量不均勻對信號強度的影響，選擇13C作為內標元素，對各元素強度進行標準化處理。在生物基體樣品中，不同組織結構13C含量具有一定差異，本實驗對樣品13C監測結果顯示，信號波動RSD值僅為4.1%，其在不同組織結構中含量基本一致，不會對結論造成影響。

3.2 鎘與其它元素在莖中的分布

為獲得印度芥菜莖中元素分布的二維圖像，整個莖樣品置于激光剝蝕樣品池內，激光束掃描后，信號被輸送到ICP MS中檢測。各元素強度經軟件處理并成像。積累型印度芥菜莖中7種元素分布如圖1所示，紅色表示元素的含量高，而紫色則表示含量較低。

由圖1可見，各元素在莖中有不同的分布特點。在植物莖組織切片中，幾乎所有元素在維管組織及其周圍細胞中分布較高，Cd大量積聚于由韌皮部與木質部組成的維管組織中，在表皮與皮層中Cd濃度也較高，但在由大量薄壁細胞組成的中間薄壁組織中分布較少，其它元素則與Cd分布特征相似。對比其它元素，Cu和Zn元素含量比Cd低；K和P在莖內部的薄壁細胞中也有一定程度的分布，但K的含量要遠高于其它元素，這表明K有很強的木質部運輸和卸載的能力，與目前普遍認為的K 是植物體移動能力很強的大量元素這一觀點一致。

3.3 元素分布的相關性分析

莖中相關性結果分析表明，Cd與P， S， K， Ca強度分布呈正相關（R2>0.3，樣品數n=5400， 圖2），而K與Ca 呈顯著正相關（r2=0.75，樣品數n=5400，圖2c），P和S呈顯著正相關（R2=0.5323，樣品數n=5400， 圖3）。Cd與Ca具有相似的分布規律，可能與二者離子半徑相近、化學性質相似有關。而K， Ca， P和S的分布呈顯著正相關，說明重金屬元素進入植株體內并被其吸收運輸過程是伴隨著植物對其它元素的吸收。

4 結 論

本實驗采用LA ICP MS質譜技術原位分析了富集型印度芥菜莖中7種元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的分布情況，通過定量分析軟件和二維成像軟件得到Cd等元素在細胞組織中的二維分布圖像，建立了LA ICP MS定量分析植物細胞中元素分布的微區二維成像方法。雙聚焦高分辨ICP MS與LA聯用技術具有分辨率高、可多元素且可選擇不同同位素同時測定、可實現相對定量的優勢，是研究植物組織中元素微區分布的強有力成像技術，在植物毒理學研究方面具有很大的潛力[17]。

要解除過量重金屬對植物可能的毒害，植物需要在細胞中找到一個合適的地方將其固定下來并永久儲存[18]。本研究表明，Cd優先儲存在由韌皮部與木質部組成的維管組織中，維管系統中的重金屬一般被認為是與木質部運輸及其向葉片中的轉運有關[19]。在富集型印度芥菜莖中Cd的這種分布形式表明可能有相當數量的Cd主要通過木質部導管運輸。除此以外，莖的韌皮部細胞中還分布著大量的Cd，表明可能有相當量的Cd可以通過韌皮部轉運重新在植物組織中分配。另外，在莖的表皮與皮層中Cd濃度也較高，由此可見，葉肉細胞、莖的表皮在應對累積的重金屬過程中也同樣發揮著重要作用。元素分布的相關性說明重金屬元素進入植株體內并被其吸收運輸過程是伴隨著植物對其它元素的吸收。

References

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8 Pozebon D， Dressler V L， Mesko M F， Matusch A， Becker J S.J. Anal. At. Spectrom.， 2010， 25（11）： 1739-1744

9 WANG Ying， GUO Yan Li， YUAN Hong Lin， WEI Yong Feng， YAN Hong Tao， CHEN Hui Hui.Spectroscopy and Spectral Analysis， 2012， 32（1）： 223-228

王 穎， 郭艷麗， 袁洪林， 魏永鋒， 閆宏濤， 陳慧慧. 光譜學與光譜分析， 2012， 32（1）： 223-228

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11 Tian S K， Lu L L， Labavitch J， Yang X E， He Z L， Hu H， Sarangi R， Newville M， Commisso J， Brown P.Plant Physiology， 2011， 157： 1914-1925

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17 Siebold M， Leidich P， Bertini M， Deflorio G， Feldmann J， Krupp E M， Halmschlager E， Woodward S.Anal. Bioanal. Chem， 2012， 402： 3323-3331

18 Brooks R R.CAB International， New York. 1998： 55-94

19 McNear D H， Peltier E， Everhart J， Chaney R L， Sutton S， Newville M， rivers M， Sparks D L.Environmental Science & Technology， 2005， 39（7）： 2210-2218

由圖1可見，各元素在莖中有不同的分布特點。在植物莖組織切片中，幾乎所有元素在維管組織及其周圍細胞中分布較高，Cd大量積聚于由韌皮部與木質部組成的維管組織中，在表皮與皮層中Cd濃度也較高，但在由大量薄壁細胞組成的中間薄壁組織中分布較少，其它元素則與Cd分布特征相似。對比其它元素，Cu和Zn元素含量比Cd低；K和P在莖內部的薄壁細胞中也有一定程度的分布，但K的含量要遠高于其它元素，這表明K有很強的木質部運輸和卸載的能力，與目前普遍認為的K 是植物體移動能力很強的大量元素這一觀點一致。

3.3 元素分布的相關性分析

莖中相關性結果分析表明，Cd與P， S， K， Ca強度分布呈正相關（R2>0.3，樣品數n=5400， 圖2），而K與Ca 呈顯著正相關（r2=0.75，樣品數n=5400，圖2c），P和S呈顯著正相關（R2=0.5323，樣品數n=5400， 圖3）。Cd與Ca具有相似的分布規律，可能與二者離子半徑相近、化學性質相似有關。而K， Ca， P和S的分布呈顯著正相關，說明重金屬元素進入植株體內并被其吸收運輸過程是伴隨著植物對其它元素的吸收。

4 結 論

本實驗采用LA ICP MS質譜技術原位分析了富集型印度芥菜莖中7種元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的分布情況，通過定量分析軟件和二維成像軟件得到Cd等元素在細胞組織中的二維分布圖像，建立了LA ICP MS定量分析植物細胞中元素分布的微區二維成像方法。雙聚焦高分辨ICP MS與LA聯用技術具有分辨率高、可多元素且可選擇不同同位素同時測定、可實現相對定量的優勢，是研究植物組織中元素微區分布的強有力成像技術，在植物毒理學研究方面具有很大的潛力[17]。

要解除過量重金屬對植物可能的毒害，植物需要在細胞中找到一個合適的地方將其固定下來并永久儲存[18]。本研究表明，Cd優先儲存在由韌皮部與木質部組成的維管組織中，維管系統中的重金屬一般被認為是與木質部運輸及其向葉片中的轉運有關[19]。在富集型印度芥菜莖中Cd的這種分布形式表明可能有相當數量的Cd主要通過木質部導管運輸。除此以外，莖的韌皮部細胞中還分布著大量的Cd，表明可能有相當量的Cd可以通過韌皮部轉運重新在植物組織中分配。另外，在莖的表皮與皮層中Cd濃度也較高，由此可見，葉肉細胞、莖的表皮在應對累積的重金屬過程中也同樣發揮著重要作用。元素分布的相關性說明重金屬元素進入植株體內并被其吸收運輸過程是伴隨著植物對其它元素的吸收。

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由圖1可見，各元素在莖中有不同的分布特點。在植物莖組織切片中，幾乎所有元素在維管組織及其周圍細胞中分布較高，Cd大量積聚于由韌皮部與木質部組成的維管組織中，在表皮與皮層中Cd濃度也較高，但在由大量薄壁細胞組成的中間薄壁組織中分布較少，其它元素則與Cd分布特征相似。對比其它元素，Cu和Zn元素含量比Cd低；K和P在莖內部的薄壁細胞中也有一定程度的分布，但K的含量要遠高于其它元素，這表明K有很強的木質部運輸和卸載的能力，與目前普遍認為的K 是植物體移動能力很強的大量元素這一觀點一致。

3.3 元素分布的相關性分析

莖中相關性結果分析表明，Cd與P， S， K， Ca強度分布呈正相關（R2>0.3，樣品數n=5400， 圖2），而K與Ca 呈顯著正相關（r2=0.75，樣品數n=5400，圖2c），P和S呈顯著正相關（R2=0.5323，樣品數n=5400， 圖3）。Cd與Ca具有相似的分布規律，可能與二者離子半徑相近、化學性質相似有關。而K， Ca， P和S的分布呈顯著正相關，說明重金屬元素進入植株體內并被其吸收運輸過程是伴隨著植物對其它元素的吸收。

4 結 論

本實驗采用LA ICP MS質譜技術原位分析了富集型印度芥菜莖中7種元素Cd， P， S， K， Ca， Cu和Zn的分布情況，通過定量分析軟件和二維成像軟件得到Cd等元素在細胞組織中的二維分布圖像，建立了LA ICP MS定量分析植物細胞中元素分布的微區二維成像方法。雙聚焦高分辨ICP MS與LA聯用技術具有分辨率高、可多元素且可選擇不同同位素同時測定、可實現相對定量的優勢，是研究植物組織中元素微區分布的強有力成像技術，在植物毒理學研究方面具有很大的潛力[17]。

要解除過量重金屬對植物可能的毒害，植物需要在細胞中找到一個合適的地方將其固定下來并永久儲存[18]。本研究表明，Cd優先儲存在由韌皮部與木質部組成的維管組織中，維管系統中的重金屬一般被認為是與木質部運輸及其向葉片中的轉運有關[19]。在富集型印度芥菜莖中Cd的這種分布形式表明可能有相當數量的Cd主要通過木質部導管運輸。除此以外，莖的韌皮部細胞中還分布著大量的Cd，表明可能有相當量的Cd可以通過韌皮部轉運重新在植物組織中分配。另外，在莖的表皮與皮層中Cd濃度也較高，由此可見，葉肉細胞、莖的表皮在應對累積的重金屬過程中也同樣發揮著重要作用。元素分布的相關性說明重金屬元素進入植株體內并被其吸收運輸過程是伴隨著植物對其它元素的吸收。

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