基于二茂鐵甲酸多重標記的樹枝狀大分子放大效應的赤霉素分子印跡電化學傳感器

付叢+李建平

摘 要 建立了多重標記模板分子提高分子印跡電化學傳感器靈敏度的方法。通過修飾有大量二茂鐵甲酸的樹枝狀大分子標記的赤霉素與樣品中的赤霉素分子之間的競爭反應來進行定量測定。由于實現了二茂鐵甲酸的多重標記，故測量電信號得到了明顯放大，靈敏度顯著提高，線性范圍為2.0×10

Symbolm@@ 10 mol/L。本方法已成功用于啤酒樣品中赤霉素測定。

關鍵詞 多重標記； 樹枝狀大分子； 赤霉素； 分子印跡； 二茂鐵甲酸； 聚三乙胺五乙酸乙二醇酯

1 引 言

赤霉素是一種植物生長調節劑，在農業生產中廣泛應用[1，2]。已知的赤霉素種類至少有38種，其中赤霉素3（Gibberellin Acid 3，GA3）活性最強，研究也最多。許多國家對食品中赤霉素的含量有著嚴格規定。因此，建立靈敏簡單的赤霉素檢測方法非常必要。目前，已報道的赤霉素的定量檢測方法有毛細管電泳 質譜法[3]、氣相色譜 質譜聯用法[4]、液相色譜 質譜法[5]＼， 毛細管電泳 熒光檢測法[6]等，但相關的電化學檢測方法還未見報道。

分子印跡電化學傳感器靈敏度高、選擇性好，是近期研究的熱點之一[7～10]，已被應用于環境監測[11，12]、藥品檢驗[13，14]、農獸藥殘留檢測[15，16]等領域。為了提高其靈敏度，開發了許多新方法[17～19]。樹枝狀大分子是一類人工合成的新型化合物[20]，一般具有對稱的高度枝化結構，表面分布大量官能團[21，22]。本實驗將二茂鐵甲酸（Ferrocenecarboxylic Acid， FcA）標記于合成的樹枝狀大分子聚三乙胺五乙酸乙二醇酯（PDTPA）表面，再將GA3與之相連形成GA3/PDTPA/（FcA）n，從而實現了模板分子的多重標記，即一個孔穴對應多個標記物。相較于單次標記的方法，信號強度大大增強，方法的靈敏度明顯提高。

2 實驗部分

2.1 儀器與藥品

CHI660C電化學工作站（上海辰華儀器公司）；三電極系統：金電極（d= 2 mm）為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。

赤霉素1， 2， 3， 4， 7（GA1， GA2， GA3， GA4， GA7）購自阿拉丁試劑公司； 鄰苯二胺（OPD）、三乙胺五乙酸（DTPA）、EDC、sulfo NHS、FcA等購于國藥試劑公司。所有試劑均為分析純，使用前不需要進一步純化。

2.2 分子印跡電化學傳感器的制備

2.2.1 GA3/PDTPA/（FcA）n的合成 PDTPA的合成及NHS EDC的使用方法均參照文獻＼[23]。將0.3 g合成好的PDTPA、 300 μL 1 mmol/L FcA和100 μL 1 mmol/L GA3分別加入3個燒杯中，再各加入500 μL 20 g/L EDC和500 μL 10 g/L Sulfo NHS，靜置反應5 h。然后在盛放PDTPA燒杯中加入400 μL 0.01 mmol/L 脲溶液并于暗處攪拌反應1 h。最后將3個燒杯溶液混合后于暗處攪拌反應1 h。制得復合物GA3/PDTPA/（FcA）n的濃度約為1×10

Symbolm@@ 4 mol/L。

2.2.2 分子印跡傳感器和非分子印跡傳感器的合成 金電極在使用前需要在先用氧化鋁粉末漿中拋光成鏡面，經濃HNO3（1∶1，V/V）、乙醇及蒸餾水洗滌。電化學聚合在10 mL 含1.0 mmol/L GA3 和3 mmol/L OPD的醋酸 醋酸鈉緩沖溶液中（pH=5.2）進行的。電聚合完成之后，用甲醇 乙酸溶液（8∶1，V/V）泡洗數分鐘，制得分子印跡電化學傳感器。

非分子印跡膜（nMIP）傳感器的制備類似于分子印跡傳感器的制備，僅在聚合過程中不加入模板分子。

2.2.3 掩蔽、競爭和孵化過程 掩蔽是將洗脫后的分子印跡修飾電極置于5 mL 1.0 × 10

Symbolm@@ 4 mol/L GA3溶液中12 min， 使GA3完全占據電極上的印跡孔穴。沖洗電極后，再將其置于合成好的配合物溶液中孵化15 min，使配合物分子取代部分孔穴中的GA3分子。沖洗孵化后的電極， 以去除電極表面的物理吸附。檢測前，將孵化后的電極置于不同濃度的GA3待測液中浸泡9 min完成競爭。

2.2.4 電極的再生使用 將使用后的電極重新在甲醇 乙酸溶液（8∶1，V/V）中洗脫10 min，以除去孔穴中的聚合物和赤霉素，并消除聚合物表面可能存在的物理吸附。清洗后進行循環伏安法掃描，至CV曲線與第一次洗脫完畢的曲線重合，即表明該電極可重新使用。

2.2.5 實驗方法 采用循環伏安法（CV）、差分脈沖伏安法（DPV）和交流阻抗（EIS）對傳感器進行表征和檢測。CV在含有K3＼[Fe（CN）6]溶液中進行。DPV檢測在含0.5 mol/L KCl的PBS（pH=7.0）中進行，掃描范圍為0.2～0.8 V，掃速為0.1 V/S。EIS檢測是在0.19 V進行，頻率范圍100 mHz～100 kHz。

3 結果與討論

3.1 分子印跡聚合物的電聚合

在金電極表面于0.1 mol/L 醋酸 醋酸鈉緩沖溶液（pH=5.2）中用CV法電聚合GA3分子印跡膜。結果表明，在0.35 V處出現了一個明顯的OPD氧化峰，并且隨著掃描圈數增加，峰電流減小并趨近于零，即可證明生成了導電性能較差的OPD膜。

3.2 分子印跡聚合物的分子識別性能

分子印跡聚合物具有特異的選擇識別性能。為了驗證此性質，分別對裸（a）、聚合后（b）、洗脫后（c）、掩蔽后（d）、孵化后（e）和在10×10

Symbolm@@ 8 mol/L GA3溶液中競爭后的電極（f）進行了CV表征，結果如圖1A所示。與曲線a相比，曲線b峰電流幾乎消失，證明在電極表面形成了不導電的分子印跡膜。由b到c峰電流增大，說明有模板分子從聚合物中洗脫下來。由c到d，電流再次減小，表明部分印記孔穴被重新占據。而由d到e， 電流再次增大，可能是由于二茂鐵甲酸是良性的導電介質。相較于孵化后（e）峰電流值，競爭后（f）峰電流進一步減小。這主要是由于在競爭過程中孔穴中的GA3/PDTPA/（FcA）n被GA3分子取代，使電極表面二茂鐵甲酸的數量減少，電流相應減小。

3.3 測量底液及其pH和KCl的影響

為了得到穩定的反應溶液，選擇不同的緩沖液（包括PBS、醋酸 醋酸鈉、硼砂、碳酸鈉 碳酸氫鈉緩沖液等）檢測經1.0×10

Symbolm@@ 8 mol/L赤霉素競爭后的電流。結果表明，在PBS溶液中反應最為穩定，得到的峰型也最好。進一步對PBS溶液的pH值進行優化，在pH=7.0時響應電流最大。為了平衡電荷和增加溶液導電性，在測量底液中加入0.1 mol/L KCl作為支持電解質。綜上所述，取含0.1 mol/L KCl的0.1 mol/L pH=7.0 PBS作為檢測底液。 圖2 分子印跡傳感器在各個步驟的AC譜圖，其中a， b， c， d， e和f分別為分子印跡電極在裸電極、聚合后、洗脫后、掩蔽后、孵化后和競爭后的AC圖

3.4 孵化時間和競爭時間優化

孵化時間是GA3/PDTPA/（FcA）n競爭下掩蔽時進入分子印跡孔穴的GA3并達到平衡過程所需要的時間。孵化實驗是在合成好的配合物溶液中進行的，每隔3 min在PBS中進行一次差分脈沖伏安測定，記錄電流響應信號，實驗結果如圖3a所示。隨著孵化時間延長，響應信號不斷增大，直至12 min后電流強度達到穩定。

競爭時間是標用GA3和分子印跡膜上的GA3/PDTPA/（FcA）n發生競爭取代并達到平衡狀態的時間。在1×10

Symbolm@@ 7 mol/L GA3溶液中，每隔3 min在PBS中進行一次DPV測定。如圖3b所示，電流的響應信號隨著競爭時間延長而降低，直至9 min趨于穩定。其它濃度更小的赤霉素溶液在該孵化液中進行競爭反應，9 min內均能夠達到平衡。

3.5 標準曲線

標準曲線如圖4所示。還原電流隨著GA3的濃度（c）增加而減小。 在2.0×10

Symbolm@@ 7 mol/L范圍內，峰電流值（I）與c呈現良好的線性關系，線性方程為

Symbolm@@ 10 mol/L （LOD=3δb/K）。

本方法簡單快速，與其它已報道的方法相比，具有更高的靈敏度，且成本很低（表1）。

3.6 傳感器的重現性

將同批次制備得到的5支分子印跡膜傳感器在10 mL含有10×10

Symbolm@@ 8 mol/L的GA3進行了5次測定，得到的RSD為3.8%。說明此傳感器具有良好的重現性。

3.7 傳感器的選擇性

赤霉素的同系物（GA1， GA2， GA4和GA7）對GA3的測定可能產生干擾。評價了傳感器的選擇性識別能力， 結果表明，對于10×10

Symbolm@@ 8 mol/L GA3，30倍的GA1， 35倍度的GA2， 35倍的GA4和 50倍的GA7無影響， RSD<5%。

3.8 啤酒樣品中GA3的檢測

應用此傳感器對啤酒中GA3進行測定，結果見表2，分子印跡傳感器的回收率為96.7%～101.3%，RSD<5%。

4 結 論

本研究提出了一種高靈敏的基于修飾樹枝狀大分子多重標記產生放大效應的分子印跡電化學傳感器檢測模式，并用于赤霉素測定。 方法簡單易行、成本低廉、選擇性好，在實際樣品測定時， 結果令人滿意。同時為提高分子印跡傳感器的靈敏度提供了一個新思路。

References

1 Yamaguchi S.Annu. Rev. Plant Biol.，2008， 59： 225-251

2 Sponsel V M， Hedden P.Plant Hormones，2010， 12： 63-94

3 Ge L， Peh C Y C， Yong J W H， Tan S N， Hua L， Ong E S. J. Chromatogr. A，2007， 1159（1）： 242-249

4 Taylor D， Blake P， Crisp C.Plant Growth Regul.，2000， 30（3）： 221-223

5 ZHONG Dong Lian， DING Ming， TANG Fu Bin， MO Run Hong， TENG Ying.Chinese J. Anal.Chem.， 2013， 41（11）： 1739-1743

鐘冬蓮， 丁 明， 湯富彬， 莫潤宏， 滕 瑩. 分析化學， 2013， 41（11）： 1739-1743

6 Liu X， Ma L， Lin Y W， Lu Y T.J. Chromatogr. A，2003， 1021（1）： 209-213

7 Haupt K， Mosbach K.Chem. Rev.，2000， 100（7）： 2495-2504

8 LI Hui Xiang， XU Xiao Li， CHEN Hui， ZHANG Song， KONG Ji Lie.Chinese J. Anal. Chem.，2012， 40（6）： 817-822

李會香， 許小麗， 陳 惠， 張 松， 孔繼烈. 分析化學， 2012， 40（6）： 817-822

9 Wang T Y， Shannon C.Anal. Chim. Acta，2011， 708（1 2）： 37-43

10 Li S， Ge Y， Piletsky S A， Lunec J.Molecularly Imprinted Sensors： Overview and Applications.Oxford： Elsevier Press， 2012： 15

11 Alizadeh T， Zare M， Ganjali M R， Norouzi P， Tavana B.Biosens. Bioelectron.，2010， 25（5）： 1166-1172

12 Dickert F L， Tortschanoff M， Bulst W E， Fischerauer G.Anal. Chem.，1999， 71（20）： 4559-4563

13 Chen H J， Zhang Z H， Cai R， Kong X Q， Chen X， Liu Y N， Yao S Z.Analyst，2013， 138（9）： 2769-2776

14 Hong C C， Chang P H， Lin C C， Hong C L.Biosens. Bioelectron.，2010， 25（9）： 2058-2064

15 Li J P， Jiang F Y， Li Y P， Chen Z Q.Biosens. Bioelectron.，2011， 26（5）： 2097-210116 Krger S， Turner A P F， Mosbach K， Haupt K.Anal. Chem.，1999， 71（17）： 3698-3702

17 Li J P， Jiang F Y， Wei X P.Anal. Chem.，2010， 82（14）： 6074-6078

18 Li J P， Chen Z， Li Y P.Anal. Chim. Acta，2011， 706（2）： 255-260

19 WEI Xiao Ping， CHANG Chuan， LI Jian Ping. Acta Chimica Sinica，2013， 71： 951-956

魏小平， 常 川， 李建平. 化學學報， 2013， 71： 951-956

20 Flory P J.J. Am. Chem. Soc.，1952， 74（11）： 2718-2723

21 Perez G P， Crooks R M.Interface Electrochem. Soc.，2001， 10（3）： 34-39

22 Zook T C， Pickett G T.Phys. Rev. Lett.，2003， 90（1）： 15502

23 Li J P， Xu Q， Fu C， Zhang Y.Sens. Actuators B，2013， 185： 146-153

24 Han Z， Liu G， Rao Q， Bai B， Zhao Z H， Liu H， Wu A B.J. Chromatogr. B，2011， 881 882（15）： 83-89

25 Hou S J， Zhu J， Ding M Y， Lv G H.Talanta，2008， 76（4）： 798-802

26 Li Y N， Wu H L， Nie J F， Li S F， Yu Y J， Zhang S R， Yu R Q.Anal. Methods，2009， 1（2）： 115-122

11 Alizadeh T， Zare M， Ganjali M R， Norouzi P， Tavana B.Biosens. Bioelectron.，2010， 25（5）： 1166-1172

12 Dickert F L， Tortschanoff M， Bulst W E， Fischerauer G.Anal. Chem.，1999， 71（20）： 4559-4563

13 Chen H J， Zhang Z H， Cai R， Kong X Q， Chen X， Liu Y N， Yao S Z.Analyst，2013， 138（9）： 2769-2776

14 Hong C C， Chang P H， Lin C C， Hong C L.Biosens. Bioelectron.，2010， 25（9）： 2058-2064

15 Li J P， Jiang F Y， Li Y P， Chen Z Q.Biosens. Bioelectron.，2011， 26（5）： 2097-210116 Krger S， Turner A P F， Mosbach K， Haupt K.Anal. Chem.，1999， 71（17）： 3698-3702

17 Li J P， Jiang F Y， Wei X P.Anal. Chem.，2010， 82（14）： 6074-6078

18 Li J P， Chen Z， Li Y P.Anal. Chim. Acta，2011， 706（2）： 255-260

19 WEI Xiao Ping， CHANG Chuan， LI Jian Ping. Acta Chimica Sinica，2013， 71： 951-956

魏小平， 常 川， 李建平. 化學學報， 2013， 71： 951-956

20 Flory P J.J. Am. Chem. Soc.，1952， 74（11）： 2718-2723

21 Perez G P， Crooks R M.Interface Electrochem. Soc.，2001， 10（3）： 34-39

22 Zook T C， Pickett G T.Phys. Rev. Lett.，2003， 90（1）： 15502

23 Li J P， Xu Q， Fu C， Zhang Y.Sens. Actuators B，2013， 185： 146-153

24 Han Z， Liu G， Rao Q， Bai B， Zhao Z H， Liu H， Wu A B.J. Chromatogr. B，2011， 881 882（15）： 83-89

25 Hou S J， Zhu J， Ding M Y， Lv G H.Talanta，2008， 76（4）： 798-802

26 Li Y N， Wu H L， Nie J F， Li S F， Yu Y J， Zhang S R， Yu R Q.Anal. Methods，2009， 1（2）： 115-122

11 Alizadeh T， Zare M， Ganjali M R， Norouzi P， Tavana B.Biosens. Bioelectron.，2010， 25（5）： 1166-1172

12 Dickert F L， Tortschanoff M， Bulst W E， Fischerauer G.Anal. Chem.，1999， 71（20）： 4559-4563

13 Chen H J， Zhang Z H， Cai R， Kong X Q， Chen X， Liu Y N， Yao S Z.Analyst，2013， 138（9）： 2769-2776

14 Hong C C， Chang P H， Lin C C， Hong C L.Biosens. Bioelectron.，2010， 25（9）： 2058-2064

15 Li J P， Jiang F Y， Li Y P， Chen Z Q.Biosens. Bioelectron.，2011， 26（5）： 2097-210116 Krger S， Turner A P F， Mosbach K， Haupt K.Anal. Chem.，1999， 71（17）： 3698-3702

17 Li J P， Jiang F Y， Wei X P.Anal. Chem.，2010， 82（14）： 6074-6078

18 Li J P， Chen Z， Li Y P.Anal. Chim. Acta，2011， 706（2）： 255-260

19 WEI Xiao Ping， CHANG Chuan， LI Jian Ping. Acta Chimica Sinica，2013， 71： 951-956

魏小平， 常 川， 李建平. 化學學報， 2013， 71： 951-956

20 Flory P J.J. Am. Chem. Soc.，1952， 74（11）： 2718-2723

21 Perez G P， Crooks R M.Interface Electrochem. Soc.，2001， 10（3）： 34-39

22 Zook T C， Pickett G T.Phys. Rev. Lett.，2003， 90（1）： 15502

23 Li J P， Xu Q， Fu C， Zhang Y.Sens. Actuators B，2013， 185： 146-153

24 Han Z， Liu G， Rao Q， Bai B， Zhao Z H， Liu H， Wu A B.J. Chromatogr. B，2011， 881 882（15）： 83-89

25 Hou S J， Zhu J， Ding M Y， Lv G H.Talanta，2008， 76（4）： 798-802

26 Li Y N， Wu H L， Nie J F， Li S F， Yu Y J， Zhang S R， Yu R Q.Anal. Methods，2009， 1（2）： 115-122