地塞米松和過氧化氫對合浦珠母貝珍珠層結構及基質蛋白表達的影響

陳 鵬, 蘇境坦, 孔 瑋, 王洪鐘, 張貴友, 謝莉萍, 張榮慶

(清華大學 生命科學學院, 北京 100084)

生物礦化在生物界中廣泛存在, 也是貝類鈣代謝的重要內容。生物礦化是生物有機體把溶液中的離子轉化成固體礦物的過程, 這個過程受到諸多因子的調控。TGFβ信號通路在脊椎動物骨形成過程中發揮重要且復雜的調控作用[1-2], NF-кB信號通路除了免疫系統, 也參與到脊椎動物骨骼的穩態維持系統之中[3], 而骨骼的生成維持是礦化過程的一個典型代表, 表明脊椎動物中TGFβ和NF-кB信號通路與礦化有著緊密關系。在貝殼形成過程中, 基質蛋白都被認為發揮了重要作用[4-6]。合浦珠母貝(Pinctada fucata)中已被鑒定的基質蛋白達數十種, 它們參與貝殼和珍珠形成的過程。因此, 研究貝中信號通路對基質蛋白表達的調控作用, 對軟體動物生物礦化分子機制的研究具有重要意義。

目前, 已從合浦珠母貝體內克隆獲得多個TGFβ超家族成員, 如pf-Smad3、pf-ALR1等和NF-кB信號通路中的一些關鍵因子pf-IKK、poIκB以及pf-Rel[7-11]。周玉娟研究發現特異性抑制pf-Smad3的mRNA表達水平可導致基質蛋白KRMP的mRNA表達水平顯著降低[12]。崔雨、王澤實等報導了核因子Pf-rel可以直接與基質蛋白Nacrein的啟動子相結合調控Nacrein的表達, 而pf-IKK可以通過調節pf-Rel的入核來調控Nacrein的表達[13-14]。可以推測, 在合浦珠母貝中,TGFβ和NF-кB信號通路也對礦化系統有著重要的調控功能。

在脊椎動物中, DEX可以抑制TGFβ和NF-кB信號通路, 而H2O2可以激活這兩個信號通路[15-20]。本研究嘗試用這兩種藥物分別作用于合浦珠母貝, 通過實時定量PCR檢測TGFβ和NF-кB信號通路中關鍵因子pf-smad3、sox9、pif-BMP2、pf-rel、pf-IKK和基質蛋白Nacrein、N19、N16、ACCBP的表達變化, 運用掃描電鏡觀察貝殼珍珠層結構的改變和利用體外碳酸鈣結晶實驗研究間液蛋白對碳酸鈣晶體生長的影響, 以期揭示TGFβ和NF-кB信號通路對貝礦化系統、尤其是珍珠層形成的調控功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑

1.1.1 實驗動物

合浦珠母貝(Pinctada fucata)取自廣西壯族自治區北海市國發珍珠養殖場。

1.1.2 實驗試劑

引物均合成于Invitrogen公司; 地塞米松購于Whatman公司; 牛血清白蛋白(BSA)、H2O2購于Sigma公司; SYBR Premix Ex Taq試劑盒購于Takara公司; 其他試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 對合浦珠母貝的藥物刺激

選取大小均勻的健康合浦珠母貝120只, 分成3組(各40只), 分別為DEX處理組、H2O2處理組以及生理鹽水處理對照組。用0.5 mm直徑注射器于每日下午固定時間分別注射4 μL藥物或生理鹽水至相應組貝的閉殼肌中。連續注射14 d。DEX終濃度為10–7mol/L,H2O2終濃度為10–4mol/L, NaCl則與海水濃度一致。

藥物刺激3、7、14 d后, 分別提取健康個體間液蛋白、外套膜組織及貝殼作后續實驗材料。

1.2.2 體外碳酸鈣結晶實驗

參考方東的方法[21], 將飽和Ca(HCO3)2溶液, 與不同濃度的間液蛋白或BSA混合, 滴于硅化蓋玻片上, 每滴溶液為25 μL, 玻片旁放置50 μL 1 mol/L的NaOH溶液吸收CO2。封閉環境下室溫結晶24 h。

1.2.3 碳酸鈣結晶速率的測定

參考Suzuki的方法[22], 在96孔板中每孔依次加入100 μL 100 mmol/L 的 NaHCO3溶液、10 μL 4 μmol/L間液蛋白或BSA和100 μL 100 mmol/L 的CaCl2溶液, 通過分光光度計連續測定570 nm處吸光值, 每組重復5次。

1.2.4 掃描電鏡觀察

將貝殼珍珠層清水洗凈處理成小片, 然后在表面噴金。噴金60s后, 置于電鏡觀測臺正中, 標記好方向, 于高真空模式下觀測。使用儀器為FEI Quanta 200掃描電鏡, 工作電壓為15 kV。

碳酸鈣晶型觀察采取類似的方法, 用無水酒精沖洗體外碳酸鈣結晶實驗后的玻片, 清洗雜質, 之后晾干脫水。

1.2.5 拉曼光譜鑒定碳酸鈣晶型

分析使用RM2000光譜儀, 激光波長為514 nm,掃描波長范圍為100～1 200 cm–1, 功率為4.6 mW, 每個樣品重復掃描6～10次。

1.2.6 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成

同周玉娟的方法[12]。

1.2.7 實時定量聚合酶鏈式反應PCR

實時定量PCR反應的特異性引物設計見附件1。

采用 SYBR Green I 試劑盒(Takara)、Mx3000PTM RT-PCR System(Stratagene)。反應體系和實驗步驟同參考文獻[12]。

2 結果與討論

2.1 藥物刺激對貝殼珍珠層結構的影響

利用掃描電鏡觀察貝殼珍珠層的結構。正常的珍珠層由梯形排列的六邊形文石小片組成, 小片邊緣整齊清晰, 表面光滑平整(圖1C)。經DEX處理后,珍珠層六邊形小片表面變得粗糙, 呈現散碎條帶狀(圖1D)。推測有可能是新形成的六邊形文石小片在生長的過程中失去了 c-軸方向的嚴格調控。由于 c-軸方向的過度生長致使文石小片的厚度增加。這與RNAi抑制Nacrein后所形成的珍珠層的結構類似[23]。此外, 有些區域珍珠層文石有過度增生和紊亂覆蓋現象(圖1G、H、I), 可能是由于珍珠層文石片層生長速度過快, 且失去精確調控, 從而導致珍珠層表面連成整片結構, 失去原有梯形生長模式的結構布局。

在H2O2處理組, 珍珠層中既有正常的文石小片,也有零碎的異常的文石小片(圖1J、K、L)。異常的文石小片無明顯的六邊形邊界, 呈碎片化, 但表面平整。它們可能是處于分解狀態而非合成狀態。

珍珠層與棱柱層的生長過渡區的觀察顯示, 相比對照組(圖2A、B、C), DEX組珍珠層生長前沿在有機基底膜(organic matrix, 圖2C、F、I短箭頭所示區域)上的生長加快, 到達基底膜前沿(圖2D、E、F)。而 H2O2組珍珠層前沿出現孔隙和裂痕(圖2I), 前端生長呈現停滯或減緩(圖2G、H)。初步推測DEX可加速珍珠層的生長, H2O2則可延緩珍珠層的生長。

2.2 間液蛋白對體外碳酸鈣晶型的影響

本實驗通過在體外模擬碳酸鈣結晶過程來檢測貝殼間液蛋白對碳酸鈣結晶的晶貌和晶型的作用,進而對比不同實驗組間液蛋白在碳酸鈣結晶的調控功能上的差異。

實驗在方解石結晶體系中進行, 分別加入不同濃度的經DEX和H2O2處理14 d后提取的合浦珠母貝間液蛋白和 BSA。BSA對照組中, 結晶都為典型方解石形態。間液蛋白組生成晶體主要呈現兩種形態, 一類為方晶形, 形態接近對照組, 邊緣有不同程度鈍化; 另一類呈啞鈴狀形態。

在光學顯微鏡下統計不同實驗組所獲的碳酸鈣晶體的比例見表1。從中可以看出, 在相同的實驗組,隨著加入間液蛋白濃度的升高, 結晶體系中的啞鈴形晶形比例呈升高趨勢。其中, DEX組促進啞鈴形晶體生成的趨勢最強, 對照組次之。進一步利用拉曼光譜儀分析三種晶體的晶型, 結果表明, 方晶形晶體為方解石, 啞鈴狀晶體為文石(圖3)。

圖1 藥物刺激對貝殼珍珠層的影響Fig.1 The effect of DEX and H2O2 on nacre of shells

以上結果表明, 隨著間液蛋白濃度的升高, 碳酸鈣的結晶形態從方解石晶型向文石晶型轉變,DEX處理組間液蛋白加強了該趨勢, H2O2處理組則減弱此趨勢。推測經DEX處理后, 促進文石生成的相關基質蛋白的表達量提高或者抑制文石生成的相關基質蛋白表達量降低, 使總體效果為加強文石的生成。H2O2處理組則總體效果相反。

2.3 間液蛋白對體外碳酸鈣結晶速率的影響

為了進一步研究不同藥物處理組的間液蛋白在碳酸鈣結晶過程中的作用, 我們進行了體外碳酸鈣結晶速率實驗。

結果顯示(圖4),與 BSA對照組相比, 加入間液蛋白的反應體系在經歷相同時間后, 570 nm的吸光度值(A570nm)都明顯升高, 而570 nm的吸光度值正反映了此時溶液中碳酸鈣晶體的多少, 這說明間液蛋白能夠提高碳酸鈣晶體的生成速率。而在相同蛋白濃度下, DEX處理組間液蛋白對碳酸鈣結晶速率的促進作用最強, H2O2處理組比DEX處理組的促進作用稍弱。

2.4 藥物刺激對信號通路和基質蛋白表達水平的影響

外套膜為兩片位于貝殼內側, 包裹覆蓋整個軟體部的膜狀結構, 軟體動物的貝殼是由外套膜分泌的物質沉積而成[24]。本次實驗通過實時定量PCR, 檢測了藥物刺激下合浦珠母貝的外套膜組織中, TGFβ和NF-кB信號通路相關基因和珍珠層形成相關的基質蛋白Nacrein、N19、N16、ACCBP的mRNA表達水平的變化, actin作為內參。

表1 間液基質蛋白濃度對體外碳酸鈣結晶的影響Tab.1 The effect of extrapallial fluid matrix protein on Calcium carbonate Crystallization in vitro

首先考察TGFβ信號通路和NF-кB信號通路相關基因的變化。結果(圖5)顯示, DEX處理組14 d樣品中, TGFβ信號通路的pf-Smad3、pif-BMP2、sox9表達水平下降約13%、13%、17%, NF-кB通路的pf-rel和 pf-IKK分別下降約 20%和 29%。H2O2處理組,Pf-Smad3, pif-BMP2, Sox9表達水平上升63%、71%、80%, pf-rel和 pf-IKK分別上升 25%和 14%。表明DEX 下調 TGFβ和 NF-кB 信號通路表達水平, 而H2O2則上調 TGFβ和 NF-кB信號通路表達水平, 并且TGFβ和NF-кB信號通路間表現出一致性變化。

與珍珠層礦化相關基質蛋白表達水平的變化如圖6所示。Nacrein、N16、N19的總體表達水平在DEX 作用下都有所降低(圖6B、C、D), 而在 H2O2作用下明顯升高。pf-smad3、Nacrein、N19的變化趨勢存在著相對一致性(圖6A、B、C)。其中, Nacrein在珍珠層形成過程中能調節晶型和生長速度, 抑制文石生成, N19能抑制碳酸鈣結晶。所以該結果有助于解釋2.1—2.3的實驗現象。而隨著時間變化顯示藥物的抑制和促進效果都有減弱趨勢, 這可能是因為生物體常見的適應性調整。N16的變化(見圖6D、DEX組3 d稍上升, 7 d表達下降)滯后于pf-smad3, 考慮到N16的功能是誘導文石生成, 此處N16的下調可能是機體對于珍珠層生長速度的拮抗性負調控。ACCBP能誘導和轉化無定形碳酸鈣, 結果顯示, 在不同藥物處理和不同時間條件下都只有小的表達水平的波動(圖6E), 不具有統計學差異顯著性, 推測ACCBP可能不受TGFβ和NF-кB信號通路的調控。

圖3 間液基質蛋白調控體外碳酸鈣結晶Fig.3 Regulation of extrapallial fluid matrix protein on Calcium carbonate Crystallization in vitro

圖4 間液基質蛋白對體外碳酸鈣結晶速率的影響Fig.4 The effect of extrapallial fluid matrix protein on crystalline velocity

以上結果有助于解釋藥物處理導致貝殼珍珠層的變化和間液蛋白功能的變化。DEX處理組珍珠層出現紊亂加速生長和H2O2組生長放緩可能是直接因為間液蛋白組分構成發生變化。DEX處理組珍珠層生長負調控蛋白Nacrein、N19和正調控蛋白N16表達都下降, 但是總體效果為促進珍珠層的生長。H2O2組Nacrein、N19和N16表達都上升, 總體效果為抑制珍珠層的生長。同時基質蛋白表達水平的變化影響間液中各蛋白組分相對濃度, 也影響到間液對碳酸鈣結晶的總體調控效果。

上述結果還顯示TGFβ和NF-кB信號通路表達水平變化的一致性, 且都與基質蛋白的表達水平變化呈正相關。這提示TGFβ和 NF-кB信號通路可能協同作用調控礦化相關的基質蛋白的表達。

2.5 DEX和 H2O2調控基質蛋白表達的可能機制和意義

圖5 藥物刺激對TGFβ和NF-кB信號通路表達水平的影響Fig.5 The effect of drug treatment on TGFβ and NF-кB signaling pathways

圖6 藥物處理對基質蛋白表達水平的影響Fig.6 The effect of drug treatment on expression level of matrix proteins

DEX和 H2O2對貝的信號通路作用的分子機制可能類似于脊椎動物中的情況。在脊椎動物體內,DEX活化糖皮質激素受體(GR), 活化的 GR在胞內直接作用于Smad3蛋白, 從而抑制TGFβ信號通路[15]。同時, DEX還可以誘導NF-кB抑制因子IκBα的表達,從而通過更多的IκBα結合NF-кB形成蛋白復合體抑制NF-кB的激活[16]。H2O2作為常見的活性氧簇(ROS),在動物細胞中能引起氧化應激反應, 直接激活TGFβ通路[17]。ROS也可促進蛋白激酶C(PKC)的激活, 活化的PKC磷酸化IκB, 導致后者與NF-кB解離而使NF-кB活化[19-20], 從而影響下游基因的表達。

已有實驗表明, 在合浦珠母貝體內也存在這兩個信號通路, TGFβ信號通路可能通過下游Sox9等因子與基質蛋白KRMP的啟動子結合進行調控[12]。NF-кB通路能通過核因子pf-rel直接與基質蛋白Nacrein的啟動子相結合進行調控[13-14]。本實驗結果則表明,TGFβ和 NF-кB信號通路可能協同調控下游多個基質蛋白。但是, 由于缺乏貝類細胞系, 細胞水平實驗無法開展, DEX和H2O2在合浦珠母貝中具體的作用機制以及 TGFβ和NF-кB信號通路如何具體調控基質蛋白還不明確, 仍需進一步的研究。

自從白細胞介素-1(IL-1)被認為是抗原刺激激活的免疫細胞分泌的可溶性因子, 同時也是激活破骨細胞的因子的現象被發現后[25], 不斷積累的證據證明, 脊椎動物的免疫系統和骨骼系統共享一些調節因子[26-27]。同時, 脊椎動物的骨骼與免疫系統在細胞起源、空間分布、功能及調控等方面存在許多相似性。由于貝殼和珍珠都是生物礦化的產物, 與骨骼有相似的形成機制。由此推測, 免疫反應與貝殼礦化之間可能也存在密切的關系。2004年, Mount 等[28]提出了“血細胞介導貝殼礦化”的新觀點, 而貝類血淋巴細胞被認為主要是履行天然免疫功能的, 暗示了貝殼的生物礦化可能與其免疫有關。

在脊椎動物體內, NF-κB信號通路最重要也是研究最透徹的作用是參與到免疫系統的信號調控之中[29]。而TGFβ信號通路也在免疫反應中起到重要作用, 炎癥初期能影響非特異性免疫[30]。熊訓浩克隆了貝合浦珠母貝中NF-кB信號轉導相關的基因Pf-ALMP并證明該基因參與免疫應答[31]。可以推測這兩個通路也參與貝的免疫反應。而本次研究顯示這兩信號通路協同作用, 共同調控珍珠層基質蛋白的表達, 提示了貝的免疫體系可能和礦化系統存在高度的關聯, 可能共用一些細胞信號通路, 或者礦化相關蛋白有部分直接為免疫相關信號通路下游所調控。

本次實驗反映的珍珠層生長與免疫相關信號通路的負相關性推測, 說明免疫系統的激活對于珍珠層的生長可能是不利的。而尋找合適的免疫抑制劑,通過下調免疫系統的水平來提高養殖珍珠的生長速度具有潛在的可行性。另外, 貝的免疫系統和礦化系統的交互調控可能具有重要的生物進化學意義。兩個系統協同作用的機制有助于增強貝類對環境改變的適應性。

3 結論

本次實驗通過DEX和H2O2分別抑制或激活合浦珠母貝的TGFβ和NF-кB信號通路, 從而調控與珍珠層形成相關的基質蛋白的表達, 并影響珍珠層的結構。結果顯示, DEX處理使得間液蛋白促進珍珠層文石生成, 而H2O2處理則相反。實時定量PCR顯示, 藥物處理下TGFβ和NF-кB信號通路平行變化, 并且與基質蛋白表達變化高度相關。推測基質蛋白的表達可能同時受到這兩個信號通路的調控, 暗示免疫體系和礦化系統可能共用某些細胞信號通路, 兩個系統的協同作用機制具有重要的生物進化學意義。本研究結果對于如何提高和控制養殖珍珠的產量和質量也具有借鑒意義。

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