鐵礦區內重金屬對土壤氨氧化微生物群落組成的影響

洪 晨,邢 奕,2*,司艷曉,2,李 洋 (.北京科技大學土木與環境工程學院,北京 00083；2.北京科技大學金屬礦山高效開采與安全教育部重點實驗室,北京 00083)

鐵礦區內重金屬對土壤氨氧化微生物群落組成的影響

洪 晨1,邢 奕1,2*,司艷曉1,2,李 洋1(1.北京科技大學土木與環境工程學院,北京 100083；2.北京科技大學金屬礦山高效開采與安全教育部重點實驗室,北京 100083)

以密云水庫上游某鐵礦區為研究對象,采用熒光定量PCR和變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析了礦區內不同采樣點的土壤中氨氧化微生物的數量和群落結構的變化,結果表明,土樣中氨氧化細菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)的數量變化范圍分別為 3.01×107～1.08×109copies/g干土和 8.65×107～2.69×109copies/g干土.重金屬含量與氨氧化微生物數量的相關性分析以及氨氧化微生物群落結構的冗余分析結果表明,該礦區內重金屬污染改變了土壤中的氨氧化微生物的數量和結構.Cu污染對AOA的數量起到了顯著抑制作用(r= -0.653*, P<0.05),但是對AOB則沒有明顯作用;Zn污染對尾礦庫區域土壤的AOA/AOB比值影響顯著(r= -0.606*, P<0.05);Cd污染改變了AOB的種群分布,降低了AOB的多樣性水平.土壤中Cr長期干擾并沒有改變氨氧化微生物的數量和結構,但是明顯得抑制了氨氧化速率,表明重金屬污染在一定程度上也影響了土壤生態系統的氮循環.

鐵礦區；氨氧化古菌(AOA)；氨氧化細菌(AOB)；DGGE；real-time PCR

金屬礦山開采和選冶活動會造成礦區及其周邊土壤環境中重金屬的累積,累積在土壤中的重金屬元素在地表徑流和生物地球化學作用下還會發生遷移,進入到周圍的大氣、水和土壤環境中,通過直接呼吸及食物鏈長期危害人體健康[1-2].土壤微生物對重金屬的脅迫要比同一環境中的動物和植物敏感得多,多種終點指標可以被用來指示重金屬對土壤微生物群落的效應,如土壤生物量、土壤呼吸、酶活性、硝化作用和固氮等.其中,硝化作用是對重金屬脅迫最敏感的土壤微生物過程之一[3].另外,硝化作用是土壤氮素轉化的重要過程,不僅關系到銨態氮在土壤中的轉化,而且與過量氮肥投入導致的土壤酸化、硝酸鹽淋失及其引起的水體污染和溫室氣體(N2O)[4]釋放等一系列生態環境問題直接相關.

一直以來,氨氧化細菌(AOB)被認為是自養氨氧化過程的最重要貢獻者.然而,泉古菌門中的化能自養氨氧化古菌(AOA)的發現,將氨氧化微生物由細菌域推進到古菌域[5].有研究表明在高氮投入的中性和堿性的環境中,AOB是硝化作用的主要驅動者,而AOA主要在較苛刻的環境包括低氮、強酸性和高溫的環境中發揮功能活性[6-8].然而也有學者認為,一般農田土壤和草地土壤中主導氨氧化過程的是 AOB而不是 AOA[9-10].因此,AOA和AOB對自養硝化過程的相對貢獻仍是爭論的熱點.各種研究顯示,復雜自然環境下不同的理化性質驅使AOA和AOB產生不同的反應,從而在氮循環中占據各自的生態位[8].

在氨氧化過程中,氨氧化細菌和古菌都有由amoA基因編碼的氨單加氧酶(AMO),其α亞基能催化NH3到NH2OH[11].因此,amoA基因是目前用來研究陸地和水體生態系統中氨氧化微生物的主要途徑.然而,采用分子生物學手段研究土壤硝化微生物功能種群的演變還處于起步階段,大部分研究圍繞著土壤理化性質如pH值、溫度、水分、底物濃度及不同土壤類型、土地利用類型[12-18]對氨氧化微生物的影響,對自然土壤中重金屬長期干擾下土壤氨氧化功能基因的變化規律[19]則研究較少.

本研究以密云水庫上游鐵礦區為例,采集了礦區內重金屬污染下的土壤樣品,分別測定其氨氧化勢(PAO),通過熒光定量 PCR和變性梯度凝膠電泳(DGGE)研究amoA基因的豐度和多樣性,得到該區域內群落組成變化與硝化作用的關聯,并在環境因子與氨氧化群落之間的復雜關系中找到重金屬對氨氧化微生物起到的作用,為進一步了解重金屬在氮循環中起到的作用提供基礎信息.

1 試驗材料與方法

1.1 樣品采集及處理

研究區為北京市密云縣北部山區某鐵礦區,位于密云水庫上游 10km以內,礦區緊挨潮河,該地區富含鐵礦資源,采礦歷史有 30年之久,采礦活動頻繁.以尾礦庫為中心,礦區內尾礦庫周圍5km的范圍內,根據村落的分布,在每一個村落周圍采集不同土地利用類型(人工林、莊稼地)的表層土壤共10個點,在尾礦庫區域采集荒漠地表層土壤共4個點,如圖1所示.在每個采樣點的不同位置按Z字型分別采樣4次,然后混合均勻作為一個樣品,并詳細記錄采樣點環境狀況,所有樣品保存在密封的塑料封口袋中.一部分土樣立刻放入-20℃冰凍箱中保存用作分子學實驗.另一部分經風干、研磨、過篩后,供土壤理化性質、重金屬含量測定,所有土壤置于4 ℃保存備用.

1.2 土壤理化性質及重金屬含量測定

土壤基本理化性質采用常規方法測定.pH值測定(水土比為 2.5:1)采用 pH 計(Starter-3C,OHAUS,USA).采用 CHNS/O (Perkin-Elmer,USA)元素分析儀測定土壤有機碳、全氮含量.有效磷采用鉬銻抗比色法測定.土壤中重金屬總量根據國家地質實驗測試中心標準(Q/GD001-2002)土壤中微量元素的密閉溶樣-電感耦合等離子質譜法測定.銨態氮采用2mol/L KCl浸提后靛酚藍比色法測定其含量.硝態氮含量采用雙波長法測定

圖1 研究區域及采樣點分布Fig.1 The study area and sampling sites location

1.3 土壤潛在氨氧化勢(PAO)測定

根據Kurola等[20]的方法,取5g鮮土于50mL離心管中,PBS緩沖液(g/L:NaCl,8.0;KCl,0.2;Na2HP04,0.2;NaH2P04,0.2;pH7.4)和 5mol/L(NH4)2SO4溶液各50mL(此時溶液中氨氮濃度為70mg/L),加入 1mL 1g/L的亞硝氮氧化抑制劑KClO3(終濃度為 10mg/L),培養后加入 5mL 2mol/LKCI提取-N,離心后用重氮化偶合分光光度法測定提取液中-N 濃度,以mg-N/(kg干土·h)表示土壤硝化勢.

1.4 熒光定量PCR

土壤總DNA采用美國MoBio公司的土壤微生物強力提取試劑盒提取.提取的 DNA純化后置于-20℃儲存.氨氧化細菌和古菌的熒光定量PCR擴增采用特異引物(表 1).于 ABI Prism 7500Real-time PCR system擴增儀上進行絕對定量PCR分析.每個樣品 3次重復,熒光定量 PCR反應體系 20μL,每個體系包括:10μL AB qPCR Master Mix (AB gene),正向和反向引物(10mmol/L)各 1.0μL,牛 血 清 白 蛋 白 1μL(10mmol/L),超純水7μL,DNA模板1μL.反應體系為:94℃ 15min;94℃ 15s,變性溫度(表 1)1min,72℃ 34s,共40個循環.根據He等[21]報道記載方法建立標準曲線,以提取的混合 DNA為模板進行氨氧化細菌和氨氧化古菌的amoA基因的 PCR擴增,將PCR產物切膠純化后,ρMD l8-T載體連接PCR產物,以大腸桿菌DH5α制備的感受態細胞轉化連接產物,在氨芐青霉素平板上進行藍白斑試驗篩選陽性克隆.取部分陽性轉化菌液進行測序.重組質粒測序結果經 GenBank的 Blast比對,分別與細菌和泉古菌 amoA基因同源性達99%.表明重組質粒可以作為氨氧化微生物進行絕對熒光定量 PCR分析的標準 DNA.提取重組質粒 DNA,用 Nanodrop(美國)測定重組質粒DNA的質量濃度,分別計算 amoA基因拷貝數,其中氨氧化細菌為 8.58×1010copies/μL,氨氧化古菌為4.8×1010copies/μL.以10倍梯度分別稀釋重組質粒,使得 DNA濃度范圍在 100～10-4ng.通過熒光定量PCR擴增分別獲得細菌、古菌的基因amoA標準曲線.其中Ct與基因拷貝數之間存在明顯的線性關系(r2>0.99,擴增效率在90%～105%之間).由標準曲線可以得出未知樣品細菌和古菌的amoA基因拷貝數.每g干土的基因拷貝數分別代表了AOB和AOA的豐度.AOA/AOB為氨氧化古菌和氨氧化細菌的豐度的比值,是研究自養硝化微生物相對貢獻率的一個重要指標.

表1 PCR擴增引物及反應條件Table 1 PCR amplification primers and reaction conditions

1.5 變性梯度凝膠電泳( PCR-DGGE)

應用表 1中所示引物對提取的礦區土壤總DNA樣品進行擴增,引物及PCR反應條件如表1所示.GC夾(CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGC GGGGCGGGGGCACGGGGG G)分別加到正向引物前面,以保證DGGE實驗的穩定和片斷的分離.25μL PCR反應體系組成如下:2×PCR預混液12.5μL,去離子水 9μL,DNA 模板 0.5μL,正向引物和反向引物(10mmol/L,上海生工)各 0.5μL.氨氧化細菌PCR反應條件:94℃預變性5min;94℃變性 30s,55℃退火 30s,72℃延伸 40s,共 35個循環,72℃最終延伸 10min,4℃保溫.氨氧化古菌PCR反應條件:94℃預變性 5min;94℃變性30s,53℃退火 30s,72℃延伸 50s,共 35個循環,72℃最終延伸10min,4℃保溫.獲得PCR產物后,取部分反應混合物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.變性梯度凝膠的制備使用北京君意公司變性梯度凝膠電泳系統.變性梯度范圍如表1所示,聚丙烯酰胺凝膠濃度是8%.在 1×TAE電泳緩沖液中,100V 的電壓下,60℃電泳 10h.電泳結束后,采用 1:10000SYBR 染色 30min后,用 Red?Personal Imaging System(ProteinSimple, Santa Clara, CA, USA)成像和拍照.DGGE圖譜中DNA條帶由凝膠成像系統分析軟件 Quantity One(version 4.6.7)識別和統計,確定各個樣品電泳條帶的多少,亮度峰值.

1.6 數據分析

以細菌種群在每一泳道中亮度峰面積的百分含量為重要值構造細菌矩陣,為降低稀有種群對排序的影響,用于排序的種群要同時滿足該種群在各樣點出現的頻度≥2和該種群在至少一個樣點的相對豐度≥1%的要求.為消除量綱不同對數據分析的干擾,對環境因子進行標準化和中心化處理,對種群信息進行中心化處理.使用 Canoco(version 4.5,Biometrics-Plant Research International,The Netherlands)軟件對土壤理化性質、重金屬以及數據化后的種群信息進行冗余分析(RDA),得到微生物種群變化的主要解釋因子.采用 Monte Carlo permutation檢驗2種RDA排序軸特征值的顯著性,置換次數均為 499次.土壤理化性質(含水率、pH值、有效磷、有機碳、全氮、、)、重金屬含量和細菌、真菌、放線菌的數量變化的相關性采用SPSS(SPSSlnc., Chicago, 1L)分析.

2 結果與分析

2.1 土壤基本理化性質和重金屬含量分析

如表 2所示,土壤 pH值的變化范圍在7.2～7.8之間,這和以往北京郊區土壤的pH值測定范圍(7.0～8.2)一致.研究區域土壤的含水率在7.59%～25.59%內,以荒草地的含水率值最低,而且有機碳(1.26～5.81g/kg)、全氮量(0.29～0.70g/kg)和有效磷(1.26～5.81mg/kg)也是在荒草地取得最低值.其它來自農田和林地的采樣點有機碳、全氮及有效磷含量均比荒草地要高,這可能與農田長期施用N-P-K復合肥有關,可能是因為長期施用化學肥料能提高難氧化有機質含量,增加土壤有機碳的氧化穩定性,從而增加土壤中碳氮含量[24],另外人工林地表覆蓋了大量植被殘落物,經過微生物的分解及緩慢的腐解過程,轉化為腐殖質,增加土壤中的碳氮儲量.

表2 土壤基本理化性質Table 2 Physico–chemical characteristics of soil samples

表3中可以看到,礦區內Cr、Cd平均含量超出北京市土壤背景值4～5倍[25],Cu、Zn超過土壤背景值約2倍,其他重金屬(Pb、Ni、Co等)并未超出該地區土壤背景值(未在表 3中顯示).就全國土壤背景值(國家土壤環境質量一級標準)而言[26],Cr、Cu、Cd平均含量均超過一級標準,其中 Cd的平均含量超過土壤一級標準 2～3倍,而Zn平均含量則未超過一級標準.以我國土壤環境質量一級標準作為重金屬污染評價的質量標準[26],計算了 14個采樣點的內梅羅綜合污染指數,結果表明,尾礦庫周圍(T1、T2、T3、T4)的 Cd含量均值達 0.68mg/kg,超過一級標準(0.2mg/kg)3倍以上,是造成該區域中度污染的主要元素.礦區內其它采樣點(S5～S14)均屬于輕度污染區域.該礦區內由于長期進行露天采礦及在選礦過程中篩分、破碎礦石,產生了大量含有重金屬元素的工業粉塵,在風力作用下擴散、沉降;另外開采過程中產生的剝離礦以及選礦后產生的尾礦,有效利用率低,長期在地表堆積,在地表徑流、風力、雨水淋溶的作用下,重金屬組分不斷地擴散遷移.這些因素均導致重金屬大量進入到周圍土壤環境中,使該礦區內土壤環境受到一定程度的污染.

表3 土壤重金屬含量Table 3 The metal content of soil samples

2.2 氨氧化勢及amoA基因豐度變化

對不同采樣點的氨氧化勢和 amoA基因拷貝數進行測定,結果如圖2、3顯示.氨氧化勢即為將氧化成的能力,可以代表土壤中的硝化作用.由圖2可以看到,以尾礦庫周圍的采樣點 T1、T2氨氧化速率最低,分別為 0.005,0.001mg/(kg·h),并且可以明顯看到,尾礦庫周圍土壤的氨氧化速率普遍較低,均值為 0.020mg/(kg·h).氨氧化速率較高的采樣點為 S10、S8,分別為 0.213, 0.171mg/(kg·h).

圖2 不同采樣點氨氧化勢變化Fig.2 Changes in potential for ammonia oxidation of different sampling sites

圖3 不同采樣點amoA基因豐度變化Fig.3 Changes in amoA gene copies of different sampling sites

由圖 3得出,AOA基因拷貝數為每克干土8.65×107～2.69×109copies,最大值出現在 S9 采樣點.AOB基因拷貝數為每克干土3.01×107～1.08×109copies,最大值在點 S10取得,兩者均是在采樣點 T2處達到最低值.所有采樣點土壤中,AOA豐度都比AOB高,AOA/AOB比率在1.21～8.69之間.

2.3 土壤理化性質、重金屬對 amoA、PAO的影響

由表 4可以看到,有效磷、有機碳、全氮、硝酸鹽都與氨氧化勢有顯著的相關性(P<0.05).由此可知,土壤理化性質是影響氨氧化作用的重要因素,這在很多研究中都已得到證實[12,15].C、N、P等為硝化微生物的機體構建提供必需元素,而且氮作為硝化作用的基質,因此土壤 C、N等的有效性均對硝化作用具有重要影響.土壤硝態氮含量高低是表征土壤硝化作用強弱的重要參數,土壤中硝態氮含量越高,說明其具有越強的硝化潛力[12,15].AOA和AOB的數量與氨氧化勢都有顯著的相關性(r=0.642,P<0.01;r=0.541,P<0.05),其中以AOA的相關性更強.說明AOA在該區域的氨氧化微生物群落生態功能中占據更重要的地位.

表4 土壤理化性質與amoA、氨氧化勢的相關性Table 4 The correlation between soil physico–chemical characteristics and amoA abundance and potential for ammonia oxidation

有機碳、有效磷、全氮都在不同程度上影響了氨氧化細菌和古菌的豐度(P<0.05),并進而影響了氨氧化作用.因此,在區域范圍內,理化性質的區別是影響AOA、AOB豐度的重要原因.這與Yao等[12]和Kelly等[27]通過對土壤采樣點中影響氨氧化微生物群落的多個環境因子進行分析,得到pH值、氮的基質濃度和磷含量是最主要的影響因子的結果相一致.賀紀正等[8]對我國典型土壤中這 2類氨氧化微生物的分布特征的研究中也發現,在區域尺度上,AOA和AOB的數量與土壤有機質含量呈顯著正相關關系,這可能是因為有機質含量影響了土壤有機氮的礦化程度,從而影響了氨氧化微生物利用NH4+的效率.

在控制土壤理化性質的線性影響的條件下,對重金屬、氨氧化勢、氨氧化微生物進行偏相關分析,如表5所示.

由表5可以看到,Cu與AOA的數量有著顯著的負相關性(r= -0.653*, P<0.05),AOA/AOB的比值與Zn存在顯著的負相關(r= -0.606*, P<0.05),說明Zn長期污染對AOA和AOB產生了不同的影響.Cd與氨氧化微生物的數量并沒有顯著相關性.Cr對氨氧化過程起著顯著的抑制作用,但是Cr與AOB、AOA均并未發現顯著相關性,說明了 Cr可能是通過其他途徑來改變氨氧化作用.

表5 重金屬與amoA、氨氧化勢的相關性Table 5 The correlation between metal content and amoA abundance and potential for ammonia oxidation

2.4 氨氧化微生物群落DGGE圖譜分析

AOA、AOB的DGGE圖譜如圖4所示,AOB的多樣性除去在T1、T2、T3取得較低值外,其他采樣點的多樣性均在1.81～2.23,條帶數在7～12之間;而AOA的多樣性的最低值在S6處,多樣性在0.65～1.75之間,條帶數在2～8條.可以看到,在該礦區內AOB的種群多樣性明顯比AOA豐富.

通過SPSS分析氨氧化勢和氨氧化微生物多樣性指數的相關性表明,氨氧化勢與AOA、AOB種類都沒有顯著相關.

圖4 礦區內不同采樣點的氨氧化細菌DGGE圖譜Fig.4 AOB (a)and AOA (b)DGGE fingerprint from different samples in iron area

2.5 環境因子對氨氧化微生物種群結構變化的影響

采用冗余分析(RDA)對影響氨氧化群落種群分布的環境因子進行了分析,結果表明,通過Monte Carlo permutation檢驗,所有排序軸均顯著(P<0.01),說明排序效果理想.AOB的RDA的前兩軸分別代表了種群 31.7%、16.0%的變異,對應了34.3%、17.3%的氨氧化細菌種群與環境因子之間關系.第 1排序軸僅與有著顯著相關性(P<0.01),說明第1軸主要反映了的變化,即從左到右含量逐漸升高.從圖5a中可以明顯看到,種群富集在含量高的地方,僅有少數種群分布在含量低的地方.第2排序軸與Cd、有機碳、全氮、有效磷、含水率呈顯著相關性(P<0.05),說明第2軸主要反映了Cd、有機碳等指標的變化,沿著第2軸從下到上,Cd含量逐漸下降,而其他指標逐漸升高.根據大部分種群的多分布在第2軸上方可以得出Cd對種群分布存在著抑制作用.

圖5 冗余度(RDA)分析環境因素對土壤中氨氧化細菌(a)及古菌(b)群落結構變化的影響Fig.5 Redunancy discrimination analysis relating environmental variables to the community structure of AOB (a)and AOA (b)in iron area

對AOA種群信息的RDA分析表明,AOA的前2軸分別代表種群56.5%、13.7%的變異,對應60.0%、14.6%的氨氧化古菌種群與環境因子之間關系.第1排序軸同樣僅與NH4+呈顯著相關性(P<0.01),第2排序軸與含水率呈較顯著相關性(P<0.05).說明AOA的種群分布僅受土壤理化性質的影響,長期污染重金屬并未對 AOA的分布起到明顯的抑制作用.

3 討論

3.1 AOA、AOB的豐度和多樣性水平

該區域內AOA和AOB的豐度變化范圍較大,但是均在肥力水平較低、污染最重的尾礦庫周圍區域達到最低值,其 AOB基因豐度為3.01×107～2.19×108copies/g干土,AOA 基因豐度為 8.65×107～9.23×108copies/g 干土,分別比相同pH 及肥力水平的土壤[28]AOA 豐度(1.54×107～4.25×107copies/g干土)提高了2～20倍,比AOB的豐度(1.24×105～2.79×106copies/g 干土)提高了近200倍,AOA/AOB比值明顯降低.而采自礦區內其他土壤如農田、林地的AOA和AOB與相同肥力水平的農田土壤[29]相比,均提高了 10倍左右,AOA/AOB比值范圍在 1.21～7.35之間,與Wessen[29]的研究相差不多.因此,重金屬污染可能影響了尾礦庫區域土壤的 AOA/AOB比值,表5結果表明,Zn與AOA/AOB的負相關性顯著(r=-0.606*,P<0.05),這種現象與其他研究者[19,30-31]的研究一致,Mertens等觀察了AOA和AOB在長期Zn污染下的數量、mRNA轉錄水平變化,顯示AOB和AOA在面對土壤Zn污染時,AOB表現出更強的抗性.

從圖 4可以看出,AOB的群落結構變化比AOA明顯得多,說明AOB更容易受到外界環境的影響,比如土壤理化性質、外來重金屬污染等.Shen等[28]的研究也表明,堿性土壤中長期施肥處理對AOB的數量及組成有明顯影響,而對AOA的影響較小.

3.2 重金屬對氨氧化微生物群落豐度和多樣性的影響

將氨氧化微生物群落豐度、多樣性水平的變化進行分析,結果表明,該礦區內重金屬污染對AOA、AOB的豐度以及AOB的種群結構產生了一定影響(表 5、圖 5).比如 Cu對氨氧化古菌的數量起到了顯著抑制作用(r= -0.653*,P<0.05),但是對氨氧化細菌則沒有明顯作用.Cd污染降低了AOB的多樣性水平卻沒有改變AOB的數量,并沒有發現Cd污染對AOA有顯著影響.產生這些結果的可能原因是氨氧化古菌和氨氧化細菌在生理學上存在著根本區別,許多研究表明,在系統發育與進化方面,AOA形成了一類完全獨立于AOB的進化分支,而且AOA的生理代謝機制與AOB不完全相同,AOA既可進行自養代謝,也可以通過混合營養方式生活[32].有研究認為氨氧化古菌的能量代謝依賴于含有Cu而非Fe的電子傳遞系統[33],這可能會影響氨氧化菌對重金屬Cu的敏感性.Cd顯著影響了AOB的種群多樣性,但是并沒有改變AOB的數量.可能因為AOB中某些種群對 Cd污染產生了抗性機制,其他種群受到抑制數量減少以致消失,而這些具有抗性的種群由于適應了污染環境,數量反而增多.

土壤中Cr長期干擾并沒有改變氨氧化微生物的數量和結構,但是明顯得抑制了氨氧化速率(r= -0.607*, P<0.05).Cr抑制氨氧化速率的可能途徑為Cr進入細胞后,對編碼氨單加氧酶的核糖核酸(amoA mRNA)的合成、轉錄過程起到抑制作用,從而導致功能酶的濃度下降逐步影響到硝化反應的速率[34].

3.3 AOA和AOB對土壤自養硝化過程的相對貢獻率

AOA和 AOB對土壤自養硝化過程的相對貢獻率是目前氮循環研究關鍵的微生物生態學問題之一[17].氨氧化微生物與氨氧化勢的相關性(表 4)表明,AOA 在該區域氨氧化過程中占據了主要地位.有效磷、有機碳、全氮與AOA和AOB的相關性都比較顯著(P<0.05),但是含水率和銨態氮與AOB有著顯著相關性(P<0.05),而與AOA則沒有相關,說明AOB相比AOA更容易受到含水率和銨態氮的影響,這也從另一方面證明了AOA比AOB更適應干旱、低氮的環境,許多研究也得出了這個結論[12,15],這就解釋了荒草地中AOA為何在氨氧化過程中占據主要生態位.本研究還發現,在礦區內的農田和林地土壤中也是AOA主導氨氧化過程,這與一些研究結果 AOB在農田、草地土壤的氨氧化過程中起主要作用相反[9],但是有些學者則認為[27],AOA具有廣泛的新陳代謝能力,能利用有機碳進行兼養和異養,因此可以在含碳量豐富的土壤中廣泛分布.該研究中 AOA與有機碳的相關性比 AOB更顯著(r=0.810**, P<0.01; r=0.532*, P<0.05),也給出了AOA在農田、林地土壤中不僅數量豐富也占據著更重要的生態位的原因.本研究還發現,雖然Cu、Zn對 AOA產生了一定的抑制作用(表 4),但是并沒有改變AOA在硝化過程中的主導地位,說明低濃度的重金屬并不足以改變 AOA和AOB生態位.

該區域內長期重金屬Cu、Zn、Cd的輕度污染改變了AOA、AOB的豐度和種群結構,但是并沒有改變AOA和AOB在硝化過程中的生態位.盡管土壤的氨氧化作用在很大程度上取決于土壤的理化性質,但是Cr與氨氧化勢的顯著相關性表明,重金屬在一定程度上也影響了土壤生態系統的氮循環.因此,該地區的重金屬污染應該引起有關部門重視,加強生態環境保護.

4 結論

4.1 AOA在該區域內氨氧化微生物的氮循環生態功能中占據更重要地位,重金屬污染對AOA的抑制作用也沒有改變AOA的主導地位.

4.2 重金屬污染對氨氧化微生物的影響表現為,Cu對 AOA的數量起到了顯著抑制作用(r=-0.653*, P<0.05),但是對 AOB則沒有明顯作用.Cd污染降低了AOB的多樣性水平卻沒有改變AOB的數量.Cd污染對AOA沒有顯著影響.

4.3 重金屬污染對氨氧化作用的影響表現為,Cr并沒有改變氨氧化微生物的數量和結構,但是明顯的抑制了氨氧化速率(r= -0.607*,P<0.05).

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Impact of long-term heavy metals pollution on ammonia oxidizing microbial community in an iron mine soil.

HONG Chen1, XING Yi1,2*, SI Yan-xiao1,2, LI Yang1(1.Civil and Environmental Engineering School, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China；2.Key Laboratory of High Efficiency Mining and Safety for Metal Mine, Ministry of Education, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China). China Environmental Science, 2014,34(5)：1212～1221

To examine the changes of ammonia-oxidizing microorganisms community in an iron mine of the upstream area of Miyun Reservoir, soil samples were collected from fourteen sites. Quantification of ammonia-oxidizing bacteria(AOB)and archaea (AOA)were performed by real-time PCR, and the microbial community structures were studied by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). The results showed that the copy numbers per gram of dry soil of AOB changed from 3.01×107to 1.08×109and the copy numbers per gram of dry soil of AOA varied from 8.65×107to 2.69×109.Pearson correlation and the redundancy analysis results showed that heavy metal pollution had changed the abundance and community structure of soil ammonia-oxidizing microorganisms in this iron area. The Cu pollution had a significant inhibitory effect on abundance of AOA (r = -0.653*, P < 0.05), but had no effect on AOB; The Zn pollution had a remarkable effect on AOA/AOB ratio of tailing area (r= -0.606*, P<0.05); Cd pollution changed the AOB community structure and reduced its diversity; The long-term interference of Cr did not change the abundance and community structure of soil ammonia oxidizing microorganisms, but inhibited the ammonia oxidation rate obviously. The results showed that heavy metal pollution affect the circulation of nitrogen in soil ecosystem to a certain extent.

iron metal；archaea (AOA)；ammonia-oxidizing bacteria (AOB)；DGGE；real-time PCR

X53

A

1000-6923(2014)05-1212-10

2013-08-27

國家自然科學基金(41273091);北京市科技新星計劃(Z111106054511043)

* 責任作者, 副教授, xingyi@ustb.edu.cn

洪 晨(1984-),男,河北三河人,北京科技大學博士研究生,研究方向為污泥脫水干化、礦區土壤修復研究.發表論文17篇.