水質中細菌總數檢驗中不確定度評定

王前 佟乃興 劉燁華（大連華信理化檢測中心有限公司）

生活飲用水及其水源水等水體受到生活污水、工農業廢水或人和動物糞便的污染后，水中的細菌數量可大量增加，其中病原菌也隨之增加，引發傳染，危害人類健康，因而水中細菌總數和大腸菌數量可反映水體受微生物污染的程度。水中細菌總數往往同水體受有機物污染的程度呈正相關。故水的細菌學檢驗對了解水體被污染的程度，在流行病學和提供水質標準中具有重要意義和價值，它是評價水質污染程度的重要指標之一。

我們采用平板計數法，檢驗水中的細菌總數，細菌總數是指1mL水樣在營養瓊脂培養基中，于37℃經24h培養后，所生長的細菌菌落的總數（CFU）。在實驗過程中根據相關規定，每次實驗必須由同一實驗人員，進行平行樣測定，因此，我們采用同一陽性水樣，做15份平行樣，對水質中細菌總數進行平行樣評定。但這個過程中一定會存在無法避免的誤差，即不確定度，本實驗在此對水質中細菌總數檢驗中不確定度進行評定。

一、實驗材料與依據

1.1 測試樣品：

以正規采樣方法采集的，已確定為陽性的水樣。

1.2 實驗材料

培養基：營養瓊脂（青島高科園海博生物技術有限公司）

稀釋水：超純水裝置制備的純化水，經121℃，高壓滅菌15min，冷卻至室溫

定量移液管、90cm培養皿、250ml錐形瓶

1.3 實驗設備

超凈工作臺 型號：BCN-1360B，生產廠家：北京東聯哈爾儀器制造有限公司

恒溫培養箱 型號：HPP-9272，生產廠家：北京東聯哈爾儀器制造有限公司

鼓風干燥箱 型號：HPG-9245，生產廠家：北京東聯哈爾儀器制造有限公司

高壓滅菌鍋 型號：ES315，生產廠家：日本Tomy

超純水裝置 型號：611UF，生產廠家：賽多利斯

1.4 實驗依據

《水和廢水監測分析方法》第四版，細菌總數的測定B（P694），

二、實驗方法：

2.1 實驗準備

2.2.1 實驗前，先將實驗用器具用高壓滅菌鍋以121℃，20min滅菌，并用鼓風干燥箱烘干；

2.2.2 超凈工作臺無菌操作區域臺面，用75%酒精擦拭；實驗前紫外照射20mins，開啟風機10mins，進行實驗操作過程中保持風機開啟；

2.2.3 確認實驗用儀器設備在檢定周期范圍內，同時可以正常使用；

2.2.4 確認水樣為陽性，同時并確認菌落范圍，原水樣菌落數超出300，稀釋10倍后菌落數在30～300之間；

2.2.5 以無菌操作，準備15份水樣。

2.2 實驗操作

2.2.1 營養瓊脂培養基滅菌后，自然冷卻，在溫度在50℃左右時，進行實驗；

2.2.2 以無菌操作的方式，取1ml水樣置于已滅菌的培養皿中，倒入15～20ml，45℃左右的營養瓊培養基，立即旋搖（不能將培養基搖到平皿外）充分混勻；一份樣品要做平行樣對照；

2.2.3 待營養瓊脂培養基凝固后，翻轉平皿，底面朝上，置于37℃恒溫培養箱培養；

2.2.4 培養24小時后，去除平皿，進行菌落計數。

2.3 數據模型

細菌總數=A××fn

式中：A培養后細菌總數 cfu/ml；

fn為樣品的稀釋倍數；

三、結果與討論

3.1 稀釋倍數不確定度分量：

根據方法要求，取1ml水樣加入到9ml無菌水中，以稀釋樣逐級稀釋；此間使用定量移液管，根據校準證書，查看10ml、1ml分度吸管誤差可計算標準不確定度分別為u1=±0.05、u2=±0.007；

3.2 菌落數計數不確定度

根據檢測方法的要求，培養15份稀釋樣品平行測定陽性水樣結果，進行對數分析：

序號Log值2.031 2.151 2.116 2.100 2.125 2.099 2.111 2.114 2.083 2.035 2.079 2.157 2.130 2.097 2.104 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0平皿1 105 135 125 134 127 125 125 126 117 114 131 134 119 110 136 Log值2.019 2.130 2.097 2.125 2.102 2.097 2.095 2.100 2.068 2.057 2.116 2.125 2.076 2.041 2.132平皿2 108 142 131 126 134 126 129 130 121 109 120 144 135 125 127 11 12 13 14 15 S2 0.00007555 0.00020854 0.00017485 0.00031527 0.00027356 0.00000150 0.00011889 0.00009211 0.00010657 0.00023059 0.00066355 0.00049206 0.00150080 0.00154109 0.00039581

所有菌落數的平均值，A平均=125 cfu/ml。

3.3 合成相對不確定度

3.4 不確定度評定結果

按照方法進行分析測定，擴展不確定度中，取擴展因子K=2，U(C)=10×2=20，即利用平板計數法檢驗水中細菌總數，不確定度評定結果為細菌總數=125±20 cfu/ml。

[1]國家環境保護總局，水和廢水監測分析方法（第四版）[M]，細菌總數的測定（P694），2002：694-697.

[2]JJF 1059-2012，測量不確定度評定與表示[S].