金屬離子對重組大腸桿菌發酵生產α—環糊精葡萄糖基轉移酶的影響

羅宇笛　李嘯　張江　石小丹

摘 要：本文研究了金屬離子對α-環糊精葡萄糖基轉移酶發酵生產的影響。首先，采用單因素分析確定幾種微量元素的最佳產酶濃度；其次，通過兩水平析因試驗確定了關鍵的影響因子及其最大響應區域，其分別是MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，MnSO4·H2O；最后，通過 Box-Benhnken中心組合試驗建立數學模型，并采用響應面分析法獲得了微量元素的最優配比參數為：MgSO4·7H2O 10.94 mmol·L-1，FeSO4·7H2O 6.48 mmol·L-1，MnSO4·H2O 0.51 mmol·L-1， CaCl2·5H2O 3 mmol·L-1。與對照組相比，酶活提高了1.4倍。

關鍵詞：大腸桿菌；α-環糊精葡萄糖基轉移酶；金屬離子；響應面設計

中圖分類號：Q93-335 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.12.003

α-環糊精葡萄糖基轉移酶（α-Cyclodextrin Glycosyltransferase，簡稱α-CGT酶，EC 2.4.1.19）是糖基水解酶α-淀粉酶家族（家族13）中的重要成員，是微生物所產的胞外酶，能夠催化4種反應——歧化反應、環化反應、偶合反應和水解反應[1-3]。

天然的CGT酶大部分來自嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿脂肪芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌和軟化芽孢桿菌，而構建的基因工程菌為大腸桿菌[4]。基因工程菌在生長和產酶過程中需要無機鹽維持細胞的滲透壓，并合成核酸等物質；一些微量元素如鈣、鐵、鋅對酶活性中心或輔酶的生成以及酶激活劑的作用有著重要影響[5-8]。本研究采用單因素實驗、兩水平析因實驗、中心組合設計實驗和響應面分析法探討了金屬離子對α-環糊精葡萄糖基轉移酶發酵生產的影響，并得到優化的配比，為α-環糊精葡萄糖基轉移酶的生產具有一定的指導意義。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種 重組大腸桿菌 E.coli BL21（DE3），由安琪酵母股份有限公司提供。

1.1.2 試劑 酵母浸出物 （FM818，簡稱YE）由安琪酵母股份有限公司生產；酵母蛋白胨由安琪酵母股份有限公司生產；其他試劑均為分析純AR。

1.1.3 培養基 斜面培養基（g·L-1）：甘油 10.0，牛骨蛋白胨 9.0，酵母浸出物（FM818） 10.0， K2HPO4 16.4，KH2PO4 2.3，MgSO4·7H2O 0.5，瓊脂粉16。

液體培養基（g·L-1）：甘油 10.0，牛骨蛋白胨 9.0，酵母浸出物（FM818） 10.0，K2HPO4 16.4，KH2PO4 2.3，MgSO4·7H2O 0.5。

1.2 方 法

1.2.1 種子培養 將斜面菌樣接入裝有50 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，制備2瓶，在37 ℃和200 r·min-1 搖床上培養8 h。

1.2.2 發酵培養 將5 mL種子瓶菌樣接入裝有100 mL液體培養基的500 mL三角瓶中，制備6瓶，在30 ℃和180 r·min-1搖床上培養40 h。

1.2.3 菌體生物量的測定 采用分光光度計測定發酵液在600 nm波長處的吸光度OD600。

1.2.4 周質空間中α-CGT酶的制備 取一定量菌體的發酵液于4 ℃、6 000 r·min-1下離心10 min，倒去上清液。用蒸餾水洗滌細胞沉淀2遍，離心（同上）后取2 g左右菌體細胞，按照比例1： 10（m/v）加入對應體積的Tris-EDTA緩沖液混合均勻。細胞懸液使用超聲波細胞破碎儀進行破碎后，于4 ℃、4 000 r·min-1下離心5 min，所得上清液為周質空間中α-CGTase酶活測定液。

1.2.5 α-CGT酶環化活力的測定 甲基橙法測定環化活性：取離心后并適當稀釋的發酵上清液100 μL，加入裝有900 μL預先用50 mmol·L-1的磷酸緩沖液（pH值6.0）配制的1%（W/V）麥芽糊精溶液的試管中，在40 ℃下反應10 min后，加入1.0 mL濃度為1.0 mol·L-1的鹽酸終止反應，再加入1.0 mL的用50 mmol·L-1的磷酸緩沖液配制的0.1 mmol·L-1甲基橙溶液，20 ℃下保溫15 min，在508 nm處測定吸光度。對應α-環糊精標準曲線計算出環糊精濃度，一個酶活單位（U）定義為在上述條件下每分鐘生成1 μmol的α-環糊精所需的酶量[9-10]。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

從10種微量元素中初步篩選出Mg2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+這4種顯著因素，分別以不同濃度加入發酵培養基中，以空白為對照，測定酶活，結果如表1所示。

從表1可以看出，4種金屬離子在較低濃度情況下都對酶活有一定的提高作用，同時，在所設計的離子濃度梯度中，均發現了峰值。為了得出這4種金屬離子的最佳配比濃度，需要做進一步的試驗。

2.2 兩水平析因實驗及結果

在單因素試驗基礎上，利用Design Expert Software（Stat-Ease Inc.， Minneapolis， MN， USA， Version 8.0）軟件設計24-2 兩水平部分析因試驗（FFD），考察MgSO4·7H2O（X1）、CaCl2·5H2O（X2）、FeSO4·7H2O（X3）、MnSO4·H2O（X4）4個因素對基因重組大腸桿菌生長和產酶的影響以及各因素之間的交互作用，以確定影響產酶的顯著因素。各因素規范值與實際值的設定水平及試驗結果見表2。

3

根據回歸分析結果（表3），得到線性回歸方程，其中包括FFD試驗所有項，如下：