CRIPTO-1在宮頸鱗癌組織中的表達及臨床意義

王培智，李曉娟

(1.河南中醫學院科技處，河南 鄭州450008;2.河南中醫學院基礎醫學院，河南 鄭州450008)

人CRIPTO-1 基因最初在人畸胎癌cDNA 的文庫中鑒定出來，因此也被稱為畸胎癌來源的生長因子-1，定位于染色體3p21.3［1］。已有研究［2］表明，CRIPTO-1 在多種腫瘤組織中呈現高表達。作者采用免疫組化和原位雜交(in situ hybridization，ISH)方法檢測CRIPTO-1 在宮頸鱗癌組織中的表達情況，并分析其表達與宮頸鱗癌臨床病理特征之間的關系。

1 材料與方法

1.1 一般資料 90 例宮頸鱗癌、30 例宮頸上皮內瘤變、30 例正常宮頸黏膜組織均來自于2008年5月至2013年8月鄭州大學第一附屬醫院及第二附屬醫院病理科存檔蠟塊。患者術前均未服用任何抗腫瘤藥物，均未接受放、化療。90 例宮頸鱗癌患者年齡為28～77 歲，平均(55.8 ±15.3)歲，其中＜50 歲38 例，≥50 歲52 例。依據WHO(1985)腫瘤細胞分化程度標準，其中高分化22 例，中分化43 例，低分化25 例。依據國際婦產科聯盟(2000)修訂的TNM 分期標準，其中I～Ⅱ期58 例，Ⅲ～Ⅳ期32 例。依據淋巴結情況，其中有淋巴結轉移31 例，無淋巴結轉移59 例。經40 g·L-1多聚甲醛溶液固定，常規脫水，石蠟包埋，連續切片，切片厚度4 ～6 μm，用于HE、免疫組化及ISH 染色。

1.2 主要試劑及探針合成 CRIPTO-1 單克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司，S-P 免疫組化試劑盒、DAB 顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。SABio-AP、預雜交液、BCIP/NBT 均購自武漢博士德生物技術有限公司。探針序列:原位雜交5’端生物素標記、全硫代修飾探針均由北京奧科生物技術有限公司合成。CRIPTO-1 探 針 序 列:5’-TCACAGCCGGGTAGAAATGCCTGAGGAAAGCAGCGGA-3’。

1.3 免疫組化 嚴格按照說明書采用免疫組化S-P法進行CRIPTO-1 蛋白檢測。以美國Novus Biologicals公司提供的切片作為陽性對照，以PBS 代替一抗作為陰性對照。

1.4 ISH 方法 組織切片經二甲苯脫蠟和梯度酒精脫水后，用新鮮配制的體積分數0.5% H2O2室溫處理約30 min;用質量分數3% 檸檬酸新鮮配制蛋白酶(0.01 g·L-1)，消化組織標本中DNA 結合蛋白，37 ℃條件下10 min;每張玻片滴加25 μL 不含探針的預雜交液，42 ℃條件下預雜交4 h;加含探針(1 ng·L-1)的雜交液，42 ℃濕盒內雜交12 h;0.1 ×標準檸檬酸鹽42 ℃條件下沖洗后，加SA-Bio-AP 37 ℃條件下10 min;漂洗后加BCIP/NBT，避光顯色2～4 h。并以不含探針的標本作陰性對照。

1.5 結果判定［3］CRIPTO-1 蛋白和mRNA 陽性信號分別為黃色及紫藍色顆粒樣物質，均位于細胞核及細胞質內。隨機選取5 個高倍鏡視野，每個視野計數不少于200 個細胞，按陽性細胞所占百分比及著色深淺進行結果判定［8］，采用9 分評分制。按照陽性細胞所占百分比:陽性細胞＜10%為1 分，10% ～50%為2分，＞50%為3 分;按染色程度強弱:陰性為0 分，淡黃(藍)色染色為1 分，中度黃(藍)色染色為2 分，棕黃(紫藍)色染色＜為3 分。然后將2 項評分的乘積作為總分，＜3 分為陰性，≥3 分為陽性。

1.6 統計學處理 應用SPSS 17.0 進行統計分析，陽性率等比較采用χ2檢驗，相關性分析用Spearman 相關分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 CRIPTO-1 蛋白表達情況 CRIPTO-1 蛋白陽性表達信號呈不同程度的黃色顆粒樣物質，主要位于鱗癌細胞的細胞質(圖1)。CRIPTO-1 蛋白在宮頸鱗癌組織中的陽性表達率(65.6%)高于宮頸上皮內瘤變組織(60.0%)及正常宮頸黏膜組織(10. 0%)(χ2=28.571，P ＜0.001)。CRIPTO-1 蛋白過表達與癌的浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期均關系密切(χ2分別為10.676、9.718 及11.227;P 均＜0.05)。見表1。

2.2 CRIPTO-1 mRNA 表達情況 CRIPTO-1 mRNA陽性表達信號呈不同程度藍紫色顆粒樣物質，主要位于鱗癌細胞的細胞質(圖1)。CRIPTO-1 mRNA 在宮頸鱗癌組織中的陽性表達率(45.6%)高于宮頸上皮內瘤變組織(23.3%)及正常宮頸黏膜組織(10.0%)(χ2=14.577，P=0.001)。CRIPTO-1 mRNA 過表達與癌的浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期均關系密切(χ2分別為13.741、4. 720 及30. 170;P 均＜0.05)。見表1。

圖1 宮頸鱗癌組織中CRIPTO-1 蛋白(A;S-P，×400)及mRNA(B;ISH，×400)的表達

表1 CRIPTO-1 蛋白和mRNA 表達與宮頸鱗癌臨床病理特征的關系

2.3 CRIPTO-1 蛋白及mRNA 在宮頸鱗癌組織中表達的相關性 在宮頸鱗癌組織中，CRIPTO-1 蛋白和mRNA 的表達呈正相關關系(r =0. 287，P ＜0. 05)。見表2。

表2 CRIPTO-1 蛋白及mRNA 表達的相關性

3 討論

CRIPTO-1 具有癌基因的特性，其在胚胎發育和細胞轉化過程中牽涉到許多不同的信號途徑［4］，包括Nodal/ALK4/Smad-2 和Glypican-1/c-Src/MAPK/AKT信號途徑，并且CRIPTO-1 持續的過表達在許多腫瘤的發生、發展中發揮極其重要的作用［5］。許多研究［6-7］報道CRIPTO-1 在正常黏膜和癌前病變組織中表達不同。此外，CRIPTO-1 的表達在癌前病變組織中顯著增加，如結腸腺瘤、胃黏膜的腸上皮生化和乳腺原位導管癌，并且CRIPTO-1 在結腸腺瘤組織中的表達水平是直接與不典型增生的程度、大小和組織學亞型有關的［8］。CRIPTO-1 的表達在高發生率的結腸癌家族的正常結腸黏膜標本中有62%可被檢測到，但低風險患者的標本中僅20%結腸腺瘤檢出CRIPTO-1 的陽性表達［9］。

本文結果顯示，CRIPTO-1 在宮頸鱗癌及宮頸上皮內瘤變組織中的表達則均存在一定程度的升高，且CRIPTO-1 蛋白及mRNA 過表達與宮頸鱗癌的浸潤深度、淋巴結轉移及TNM 分期有關，這就提示CRIPTO-1蛋白及mRNA 的過表達可能與腫瘤的發生、發展、浸潤、轉移及進展過程有密切的關系。此外，宮頸鱗癌組織中CRIPTO-1 蛋白的表達與CRIPTO-1 mRNA 的表達呈正相關，提示兩者表達具有一致性，聯合檢測有助于正確評估患者的病情進展，給臨床治療方案的制定提供一定的參考依據。

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