草坪草高羊茅高溫誘導抑制差減雜交文庫的構建及其表達

王海宏等

摘 要：為了深入研究草坪草對抗高溫逆境的分子遺傳機制，構建高羊茅在高溫脅迫下相關的基因文庫。研究以冷季型草坪草高羊茅為研究對象，在長期生理試驗的基礎上，通過構建高羊茅在高溫脅迫下的SSH文庫，挑選部分陽性克隆進行測序，并對所獲得的差異基因序列進行分析，研究了在38 ℃/30 ℃（晝/夜）培養箱中進行高溫脅迫6 h的高羊茅葉片和對照組高羊茅葉片的RNA差異。結果表明：試驗得到的差減文庫中大量組成型表達的基因已經被有效去除，使某些特有的差異基因得到了富集；兩個文庫的基因片段的長度分布在200～900 bp，平均片段長度約500 bp左右；在構建的高羊茅耐熱cDNA文庫中隨機挑選了123個大小約500 bp左右的EST測序，共得到100個有效序列，其中38個是未知序列，其余62個為已報道序列，但是序列功能全部未知，這些EST 中有25個與葉綠體染色體有關，其中9個與已提交的羊茅屬植物葉綠體內的基因同源。本試驗最終得到了合格的差減文庫并對部分基因進行了測序，可為高羊茅耐熱基因的研究提供依據，同時也為提高草坪草水肥調控措施提供了理論基礎。

關鍵詞：冷季型草坪草；高羊茅；抗熱性鑒定；表達序列標簽；抑制差減雜交；生物信息學

中圖分類號：S543+.9 文獻標識碼： A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.08.001

Abstract： In order to study the molecular genetical mechanisms about how turfgrass against heat stress， suppression subtractive hybridization was used to construct cDNA library of tall fescue stress-related genes at a high temperature. Experimental material was cool-season turfgrass tall fescue. On the basis of long-term physiological experiments， by building SSH library of tall fescue under high temperature stress， some positive clones to be sequenced were selected， and the differences in gene sequences were analyzed. Thus， the differences between the control group and treatment group of tall fescue leaf RNA were studied， the treatment group was the plant on the temperature stress of 38 ℃/30 ℃（day / night） incubator for 6 h. The results showed that a large constitutively expressed genes of the subtractive library had been effectively removed， so that some of the specific enrichment of differentially expressed genes obtained； Length of the two gene libraries distributed in 200～900 bp， the average fragment length about 500 bp； in the library， 123 of about 500 bp in size EST to be sequenced were selected randomly， and a total of 100 valid sequences had been got， of which 38 were unknown sequence， and the remaining 62 had been reported， but the entire sequence function were unknown. There were 25 of these EST were related about chloroplast genome， of which 9 were homologous with a submitted fescue plant chloroplast gene. The trial finally got qualified subtracted library， and some genes were sequenced， it may provide the basis for the study of tall fescue resistant genes， as well as provide a theoretical basis of the measures to improve the regulation of turfgrass fertilizer.

Key words： cool-season turfgrasses；tall fescue；heat resistance identification；expressed sequence tags；suppression subtractive hybridization；bioinfomatics

凌志高羊茅（Festuca arundinacea cv. Barlexas）作為耐熱性較好的冷季型草坪草，近年來在亞熱帶地區得到廣泛應用。但是，高溫脅迫仍然是影響其夏季成坪效果的首要限制因素，因此，冷季型草坪草的耐熱機理、如何提高其耐熱性以及培育耐熱新品種一直是草業科學的研究熱點。傳統研究主要從生理生態學角度對比熱敏感和耐熱植株在熱脅迫下的形態和生理特征，以及植株在熱脅迫前后的生理生態變化，通過一些物理手段，或者外施一些化學物質來改善草坪草的耐熱性。現有研究已經知道植物對環境產生的大多數響應都得通過改變基因表達來實現，因此，與草坪草耐熱性相關的基因必然成為深入研究草坪草耐熱性的重點和關鍵問題。

隨著現代生物技術的發展和計算機科學與生物學的結合，研究者已經可以系統地了解熱脅迫狀態下的差異基因表達。基因差異表達的方法有很多種，如差異雜交（Differential Hybridization）、cDNA微點陣雜交（cDNA Microarray Hybridization）、寡核苷酸微點陣雜交（Oigonucleotide Microarray Hybridization）、RNA任意引物PCR指紋（RNA Fingerprinting by Arbitrarily Primed PCR，RNA AP-PCR ）、差異顯示反轉錄PCR （Differential Display RT-PCR， DDRT-PCR ）、基因表達系列分析（Serial A nalysis of Gene Exp ression， SAGE），等等。盡管這些方法均不完善，但是已經有大量的重要基因通過這些方法得到了分離和鑒定[1-2]。

目前分離并克隆草坪草抗逆基因的研究已有部分報道。2005年謝永麗[3]對草坪草狗牙根中抗逆基因BeDREB進行了克隆及功能鑒定；2006年又分離了狗牙根中周期素cyclinD基因片段[4]；Jiang等[5]利用抑制差減雜交的方法研究了耐高溫剪股穎的高溫脅迫響應基因；Xu等[6-7]在熱脅迫下對比了剪股穎耐熱與不耐熱品種根、莖中的基因差異表達，鑒定和描述了蘋果菌素基因AsEXP1與剪股穎耐熱性的關系。本研究以冷季型草坪草高羊茅為研究對象，首先構建SSH差減文庫，對克隆斑點進行雜交，通過信號掃描獲得陽性克隆，然后對上調基因和部分顯著下調基因進行測序，獲得差異基因序列。然后利用生物信息學方法，以試驗所獲得的序列為基礎，利用提供的軟件和數據庫，采用網上提交的方法對EST進行序列特征及結構和功能預測，為高羊茅耐熱基因的研究提供依據，同時為提高草坪草水肥調控措施提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 試驗材料為凌志高羊茅（Festuca arundinacea cv. Barlexas），種子購自北京克勞沃種子公司。選擇健康的草坪草種子播種在裝有混合培養基質（沙子∶蛭石∶有機營養土 = 3∶1∶1）的聚乙烯花盆中。聚乙烯花盆直徑為13 cm，深14 cm，每盆播種175～180粒種子。所有盆缽在室外自然光照下進行培養，氣溫為15～26 ℃。盆缽內的草坪草每天用自來水澆灌至盆缽底有水從小孔滲出，每周用Hoagland營養液[8]澆灌1次。20 d后將所有盆缽再轉移到人工氣候箱（型號：LRH-300-CS，廣東省醫療器械廠生產）培養14 d，管理方式同上，人工氣候箱被設置為14 h的光周期，光照強度為400 μmol·m-2·s-1， 相對濕度為（65 ± 10）%， 溫度為26 ℃/15 ℃ （晝/夜，對照溫度）。盆缽在人工氣候箱內隨機擺放并定期交換以保證每盆所受內部環境影響一致。然后將一半草坪草轉入38 ℃/30 ℃（晝/夜）的培養箱中進行高溫脅迫（處理植株），光照、相對濕度以及管理方式均與對照溫度下光照培養箱中的一致。另一半仍舊在原條件下培養作為對照植株。在脅迫第6小時時取處理和對照的高羊茅葉片分別提取總RNA進行試驗。

1.1.2 SSH文庫構建試劑 RNAisoTM Plus，D9108B，TaKaRa；RNAiso-mate for Plant Tissue，D325S，TaKaRa；Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit，635000，Clontech；PCR-Select cDNA Subtraction Kit，637401，Clontech；DL2000，條帶依次為2 000，1 000，750，500，250，100（Marker），D501A，TaKaRa；QIAquick PCR Purification Kit，28104，Qiagen；Advantage 2 Polymerase Mix，639201，Clontech。

1.2 試驗儀器

PCR儀，ABI 9700型PCR擴增儀；凝膠成像系統，Tanon 2500，天能公司；紫外分光光度計，GeneQuant II，Pharmacia Biotech；離心機，5418型，eppendorf；PCR管，吸頭，深孔板均為Axygen產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 高羊茅總RNA提取與mRNA的分離、純化 取50～100 mg組織于液氮中研磨，加入緩沖液1 mL，然后提取組織總RNA。將總RNA溶于DEPC-H2O，用Dnase I 37 ℃處理30 min，抽提純化RNA。用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度及純度。

1.3.2 高羊茅SSH文庫的構建 利用提取出的RNA反轉錄合成cDNA，隨后對反轉錄得到的cDNA進行純化以及cDNA RsaI酶切，將雙鏈cDNA消化成短的平端cDNA片段，便于下一步的差減和接頭連接，具體可參考PCR-Select cDNA Subtraction Kit說明書。隨后進行接頭連接和差減雜交，差減雜交進行兩輪，并且對兩輪差減雜交結果進行差減PCR。純化PCR產物，提取4 mL，并用TaKaRa公司的PMDl9-T Vector連接消減雜交片段。采用氯化鈣二次重懸法制備大腸桿菌感受態。取出儲存于-80 ℃的大腸桿菌菌株的保存菌液，37 ℃下，轉速為225 r·min-1，擴大培養約至2.5～3.0 h， OD600=0.4為止。將0.1 mol·L-1CaCl2溶液用冰浴冷卻，提取2 mL并輕輕重懸菌體至均勻，冰水浴30 min后，得到感受態細胞懸液；加入5 mL連接產物，并輕輕震蕩混勻，在恒溫振蕩器上復蘇培養80 min，讓受體菌恢復正常生長；37 ℃在LB固體培養基平板上均勻涂布Amp（50 μg·mL-1）、x-gal（80 μg·mL-1）和IPTG（0.5 mmol·L-1），倒置培養于恒溫培養箱中14～16 h，直至長出大小合適的藍、白菌落。取白色飽滿菌落置于96細胞培養板，于37 ℃下靜置培養16～20 h，加入13 μL甘油（甘油經過高壓蒸汽滅菌）混勻，-70 ℃保存，即可建成SSH文庫。

1.3.3 高羊茅差異表達序列測序及其分析 用巢式PCR引物Primer 1和Primer 2R來進行菌液PCR擴增，進一步篩選陽性克隆，選取96孔板克隆拿到生物工程（大連）有限公司去測序。應用VecScreen除去構建文庫時用的載體及引物接頭序列，并舍棄低質量序列。利用Blast在GenBank中尋找同源序列，并了解其基因功能。同時結合KOBAS程序進行基因功能歸類以及代謝途徑分析，并對功能蛋白進行分類和注釋。

1.4 數據處理分析

本試驗數據用Excel軟件進行統計處理和表格制作；圖片數據是由凝膠電泳儀產生，直接使用；另外得到數據后利用Blast程序在GeBank數據庫中進行了搜索和分析。

2 結果與分析

2.1 高羊茅葉片RNA純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值可用來檢測RNA純度，1.8～2.1是正常的比值范圍。各項試驗對RNA純度要求不一，即使比值略超出這個范圍，所得樣品也可用于一些普通試驗，如RT-PCR、Northern雜交、RNA酶保護和熒光定量PCR等。高羊茅葉片RNA純度如表1。

通過電泳檢測，加樣于1%的瓊脂糖凝膠孔中，在紫外透射光下觀察和拍照發現：28S和18S核糖體RNA條帶非常亮且濃，在加樣孔的看圖模式下，上面一條帶（28S）的密度約是下面一條帶（18S）的2倍。下方有可能觀察到一個更小的稍微擴散的帶，是低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA等）組成。在28S和18S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，這可能是由mRNA和其它異型RNA組成。在RNA制備過程中若出現DNA污染，將會出現在28S核糖體帶的上面，此時最好對總RNA進行純化。

2.2 高羊茅葉片cDNA的SMART合成

取1 μg高質量的Tester和Driver總RNA作為模板，用SMART技術合成cDNA雙鏈，從電泳結果可以看出，條帶呈彌散狀，cDNA分子量主要分布在200～3 000 bp范圍內（圖2）。分別進行了18，21，24次循環，從電泳圖中可以確定最佳的循環參數為21次，條帶明顯亮于其他循環次數。

2.3 高羊茅的RsaI酶切質檢圖

經四堿基識別的RsaI酶切之后，雙鏈cDNA分布在100～2 000 bp。從圖3可以看出，酶切后cDNA片段分布范圍與酶切前相比略有下移，說明RsaI已經將雙鏈cDNA切成小片段，這有利于接下來的接頭連接和雜交。

接頭連接效率對差減效率至關重要，一般通過檢測基因Tubulin差減前后表達量的差異大小來衡量差減效率的高低。Tubulin引物可以產生一條大小為497 bp的片段，但中間沒有RsaI酶切位點，擴增結果是單一條帶。由圖4可知，Tubulin3′引物與接頭引物產生的條帶亮度大于等于Tubulin3′和5′引物產生的條帶亮度的1/4，說明接頭連接效率符合要求。由于本試驗所用試驗材料基因信息很少，管家基因未知，因此，直接使用接頭引物擴增來驗證連接效率，一般如果接頭引物能夠擴增出來就認為成功接頭（圖4）。

2.5 高羊茅的差減效率檢測

差減效率是文庫構建中很重要的部分，高質量的差減文庫必須能有效地去除高豐度的組成型表達基因，以便大大提高稀有基因在文庫中出現的幾率。一般利用 Tubulin 基因擴增差減前后的雙鏈 cDNA，用兩者之間 Tubulin 基因達到相同亮度時循環數的差異來衡量差減效率高低。循環差異達到10 個以上說明已經有效地去除了大量組成型表達的基因。在未知管家基因的情況下，一般也是用接頭引物來做的，因為相同的基因被差減，差減后的條帶范圍看起來比差減前小，即認為差減合格。從本試驗中可以明顯看出差減后條帶變窄（見圖5），因此，我們認為其差減合格。

2.6 高羊茅的抑制消減文庫cDNA片段大小的檢測

隨機挑取SSH文庫中的陽性克隆至5 mL LB液體培養基中，37 ℃下搖菌過夜，模板用過夜菌液來進行菌落PCR擴增。如圖6所示，插入片段大小不同，大小介于100～1 000 bp之間，還有幾種位于250～750 bp之間。據有關報道，RsaI酶為四堿基識別酶，約在256 bp處有一個酶切位點，而酶切后的cDNA片段一般小于600 bp[8]，電泳結果說明所構建的SSH文庫的插入片段大小符合要求。

2.7 高羊茅的EST序列分析

將3個大小約500 bp左右的EST，送往上海歐易生物有限公司測序。所得結果經過前處理、聚類和拼接，共得到100個有效序列，其中38個未知序列，其余62個為已報道序列，但是序列功能全部未知。根據NCBI數據庫中的描述，這些EST中有25個與葉綠體染色體有關，其中9個與已提交的羊茅屬植物葉綠體內的基因同源。

對獲得的EST用BlastN和BlastX工具進行序列比對。在能量和基礎代謝類中，參與光合作用及葉綠體結構建成的基因最多，如1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco），Rubisco活化酶、葉綠素a/b結合蛋白等出現的頻率都較高；當植株受到脅迫時，光合作用首先響應，也受到最大的傷害，可能因此與葉綠體相關的基因最多。

本次試驗僅僅在陽性克隆中挑選了部分相關性可能較大的序列進行了測序，受數據量的限制，未發現已知功能的序列，如果加大測序范圍，或者加大隨機克隆的數量，有可能會找到已知功能的序列。差異基因的表達量和脅迫時間也有著重要關系，SSH方法只能對比脅迫的兩個時間點，可能遺漏部分差異基因，因此，研究結果具有不確定性。

3 討 論

3.1 高質量 RNA是構建高質量文庫的基礎

反轉錄前必須檢測tester和driver的總RNA的質量，高質量的RNA是差減文庫構建成功與否的關鍵因素之一。本試驗在總RNA提取、純化的每一個步驟都進行嚴格的檢驗，確保其質量滿足建庫的要求。檢測RNA溶液的純度方法之一是看A260/A280的比值，其范圍一般是1.8～2.1。本試驗中高羊茅葉片RNA溶液的A260/A280的比值在2.1左右，質量合格。試驗發現28S和18S核糖體RNA條帶非常亮且濃，在加樣孔的看圖模式下，上面一條帶（28S）的密度約是下面一條帶（18S）的2倍。但是存在一定的彌散現象，因此必須對總RNA進行純化以滿足試驗要求。

運用SSH進行一輪差減雜交，可富集稀有序列1 000倍以上[9]，使某些低豐度表達的mRNA有望被檢出。Von Stein等[10-11]的研究表明，SSH的陽性率達94%，而且與mRNA差異顯示技術[12]、cDNA-AFLP[13]相比，SSH可同時分離出上百個差異表達基因。由于試驗材料有限，提取的總量有限，所以在建高羊茅消減雜交進行反轉錄時直接進行總反轉錄，從本次試驗所建成的文庫質量以及下面的試驗結果來看，用本方法可以成功地構建高羊茅熱脅迫的抑制消減雜交文庫。

3.2 構建高羊茅cDNA消減文庫的重要性

cDNA的克隆和測序是確定在一種生物體、某一器官、某一發育階段表達基因的核苷酸序列的快速方法。為加快這一進程，研究者往往并不首先去讀取基因的全長序列，而是先從部分基因片段開始研究，為每一個基因確定一個足以成為其獨特標記的片段，即表達序列標簽（ESTS）[14]。ESTS通常包含能夠反映該基因可能具有功能的結構信息，以及與其他基因之間相互關系的信息。本研究應用抑制性差減雜交的方法，以熱脅迫和對照高羊茅葉片為材料，提取RNA并合成其相應的cDNA，再由Rsal酶切后產生一個以上的cDNA片段，最終獲得了許多基因的表達序列標簽[15]。這些基因片段將是筆者研究高羊茅受到熱脅迫時差異性表達基因的重要線索，同時也提供了探索抗熱基因響應機理的分子基礎。消減雜交是構建差減cDNA文庫的核心，消減文庫是否構建成功，很大程度上決定于差減雜交的效率，差異基因片段的大小和重組率。從本次試驗構建的文庫評價指標來看，筆者已成功地獲得了目標消減文庫。該庫的成功獲得為下一步的試驗提供了研究平臺。

3.3 選擇抑制消減雜交作為研究方法的依據

SSH技術快速有效，可以分離差異表達基因，和其它篩選差異基因的技術相比，它具有以下優點：（1）特異性好。擴增差異表達的目的cDNA片段具有選擇性，抑制非目的片段擴增，可篩去那些在細胞或組織普遍表達的基因，提高了篩出率。（2）靈敏度高。利用了二級動力學原理，在退火時產生同源雜交的速度方面，豐度高的單鏈DNA要快于豐度低的單鏈DNA，使豐度上有差別的單鏈DNA的相對含量相同，可有效克隆出極低豐度的差異表達基因。（3）高效快速。 SSH可同時分離幾十個甚至幾百個差異表達基因。（4）操作簡便，對儀器設備的要求不高。鑒于這些優點，筆者選擇了該方法構建高羊茅熱脅迫的抑制消減文庫。

但SSH技術也存在一些缺點。首先，SSH 技術要求起始的mRNA量很大（>2 μg），這是一個限制性因素，提高了對來源受限的樣品的要求。其次，SSH技術采用的是四堿基識別的限制性酶如RsaI來酶切，該酶在相距256 bp處存在一個酶切位點，酶切片段大小一般小于600 bp（50～1 000 bp）[16]，其優點是：適于與接頭連接[17]，防止長鏈cDNA片段形成的復雜結構對差減雜交效率的干擾，可滿足翻譯產物同源性預測和同源基序篩選的要求[18]。但由于限制性酶的引入使最終獲得的是片段庫，而非全長cDNA文庫，要獲得基因的全長還要借助其他分子生物學手段，如RACE技術或篩選全長cDNA文庫。

4 結 論

（1）試驗最終構建了高羊茅抗熱正向和反向差減文庫，每個文庫分別隨機挑選了384個基因進行克隆。兩個文庫的基因片段的長度分布在200～900 bp，平均片段長度約500 bp左右。

（2）在通過抑制差減雜交構建的高羊茅耐熱cDNA文庫中隨機挑選了123個大小約500 bp左右的EST，測序后共得到100個有效序列，其中38個未知序列，其余62個為已報道序列，但是序列功能全部未知。根據NCBI數據庫中的描述，這些EST中有25個與葉綠體染色體有關，其中9個與已提交的羊茅屬植物葉綠體內的基因同源。

（3）試驗得到合格的差減文庫，其中大量組成型表達的基因已經被有效去除，使某些特有的差異基因得到了富集。這可為后續的高羊茅耐熱基因的研究提供依據，同時也為提高草坪草水肥調控措施提供理論基礎。

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