豬繁殖與呼吸綜合征病毒新疆株的分離與鑒定

2014-12-09 22:37:56張美玲簡子健陸桂麗等

天津農業科學 2014年11期

張美玲　簡子健　陸桂麗等

摘要：為了解豬繁殖與呼吸道綜合征在新疆的流行現狀，以及病毒毒株的分子生物學特征，對疑似該病病料進行地方毒株的分離，并對其進行鑒定。采集新疆烏魯木齊市七道灣某豬場疑似PRRS病死的豬只肺臟及淋巴結等組織病料，將其處理后接種到Marc-145細胞上，并盲傳3代；對分離株進行毒力測定（TCID50），應用RT-PCR方法對出現CPE的細胞培養物進行分子檢測。結果顯示，分離到的新疆病毒株可發生細胞病變，在Marc-145細胞上的TCID50為10-5·mL-1。RT-PCR檢測結果用瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因序列，將測序結果與GenBank已發表的PRRSV毒株基因序列進行對比分析。研究證明所分離到的病毒為PRRSV，命名為XJ-Q。

關鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；分離；鑒定

中圖分類號：S852.651 文獻標識碼： A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.11.008

豬繁殖與呼吸道綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）俗稱藍耳病，是豬群發生以繁殖障礙和呼吸系統癥狀為特征的一種急性、高度傳染的病毒性傳染病。其臨床特征是仔豬出現不同程度的呼吸道病癥及待產母豬的繁殖障礙，如木乃伊胎、弱仔、死胎或流產，死亡率高[1]。該病于20世紀80年代末、90年代初在美國報道，而后迅速傳遍世界各個養豬國家，在豬群密集、流動頻繁的地區更易流行，常造成嚴重經濟損失[2]，嚴重影響了養豬業的生產安全。1987年PRRS首先發現于美國，1991年，Wensvoort等首次利用豬肺泡巨噬細胞（PAM）從中分離出了PRRS病原（Lelystad）[2]。中國于1996年由郭寶清等[3-6]首次從流產胎兒中分離到豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV），從而證實我國也存在豬繁殖與呼吸綜合征，之后迅速蔓延至全國各地區[7-8]。為了解該病在新疆的流行現狀，及PRRSV抗體依賴性和高變異性增強等特點，進一步豐富 PRRSV毒株基因組的信息數據，筆者對采自新疆烏魯木齊七道灣地區的病料組織處理后經Marc-145細胞培養后得到的培養物進行毒力測定、RT-PCR鑒定及測序鑒定，得到新疆地方毒株，為進一步了解該病的流行現狀及其生物學特性提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集在新疆烏魯木齊市某養豬場無菌采集疑似豬藍耳病死豬的肺臟、淋巴結等組織病料，-70 ℃保存備用。

1.1.2 細胞及血清 Marc-145細胞系，由畜牧科學院獸醫研究所傳染病實驗室提供；胎牛血清（FBS）為生工生物產品。

1.1.3 主要試劑及試劑盒胰蛋白酶和青鏈霉素實驗室保存，DMEM培養基、Trizol試劑為生工生物產品；TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）、DNA Marker DL2000購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 病料處理青鏈霉素清洗病料數次，剪碎、研磨，加入適量的DMEM培養液將其稀釋至1∶3，反復凍融3次，分裝至1.5 mL無菌離心管中，3 000 r·min-1離心10 min后留上清液，0.22 μm過濾膜除菌，保留濾液為待分離病毒液，保存在-70 ℃備用。

1.2.2 細胞培養復蘇Marc-145細胞：從液氮罐中取出細胞凍存管，瞬時放于37 ℃水浴恒溫鍋內，同時用鑷子輕輕搖晃凍存管2 min將管內物質完全融化后，在生物安全柜內用移液器取出Marc-145細胞移入離心管中，加入無FBS DMEM至4.5 mL，1 000 r·min-1離心5 min。倒掉上清液，補加細胞生長液至7 mL，用吸管慢慢吹打混勻，移入培養瓶中，在倒置顯微鏡下觀察細胞是否吹打散開，放入37 ℃的CO2培養箱中，左右搖晃，擰上培養瓶瓶蓋（不可擰緊，稍有空隙，保證CO2能進入瓶內）。隔夜后，棄去舊培養液，用無FBS DMEM培養液洗1次瓶內細胞，再加入7 mL生長液（含10%胎牛血清FBS），酒精棉球擦拭瓶蓋及培養瓶上半身，放入培養箱內，如此傳至第3代進行病毒分離。

1.2.3 病毒分離將1.2.1處理后的病料上清液經0.22 μm過濾除菌，取1 mL過濾菌液接種于單層的Marc-145細胞，37 ℃溫箱中吸附60～90 min，期間每30 min搖晃1次，使病毒液均勻接觸細胞層，而后加入維持液（含2%胎牛血清）至7 mL，放于5% CO2 37 ℃培養箱培養3～5 d。盲傳3代，觀察細胞病變（CPE）。

1.2.4 病毒的電鏡觀察取致細胞病變的細胞培養物，反復凍融3次，1 000 r·min-1離心15 min，濃縮后加0.8%甲醛滅活，2%磷鎢酸負染，透射電鏡觀察。

1.2.5 病毒TCID50滴定將長成單層的Marc-145細胞消化后移入96孔培養板內，每孔細胞單層生長大約80%密度，用于接種病毒，步驟如下。

待測病毒液稀釋：將病毒液置于滅菌后的EP管中，采用維持液培養基進行10倍遞增稀釋，取10-3～10-7稀釋度，每個稀釋度5個孔，每孔加入病毒液100 μL，同時設置2列對照孔（用維持液代替病毒液）。置于37 ℃ 5% CO2培養箱中吸附1 h，之后棄去病毒液，用無血清的DMEM洗滌后，加入100 μL維持液培養48 h后逐日觀察，直至第5天記錄出現CPE的孔數，計算CPE比率。

按Reed-Muench兩式法計算TCID50。

1.2.6 病毒RNA的提取及RT-PCR 病毒RNA的提?。喝?50 μL病毒液，按照生工生物公司Trizol劑盒的操作步驟提取病毒總RNA。

RT-PCR反應。按照TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）試劑盒，利用自行設計的特異性引物，在PCR反應管中加以下溶液及試劑：RNA模板0.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，2.5 mmol·（LdNTPs 2.5 μL）-1，引物（上、下游引物）1 μL，MgCl2 5 μL，RNase Inhibitor（4 μ·μL-1） 0.5 μL，AMVRTase 0.5 μL，AMV-Optimized Tap 0.5 μL，用無RNA酶水補足25 μL。PCR反應條件：預變性溫度50 ℃，時間30 min；預變性94 ℃，時間2 min；變性溫度94 ℃，時間30 s；退火溫度56 ℃，時間30 s；延伸溫度72 ℃，時間1 min，循環次數30；延伸溫度72 ℃，時間10 min。

電泳：取PCR擴增產物5 μL用0.8%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg·mL-1EB）電泳，100 V電壓40 min進行電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 病毒分離結果

2.2 病毒的電鏡觀察

2.3 PRRSV分離株TCID50測定結果

統計接種病毒的96孔細胞培養板，在5 d后出現CPE的情況，并用Reed-Muench法計算距離比得出TCID50結果為10-5·（100μL-1），即PRRSV分離株在Marc-145細胞上的增殖毒價為TCID50105·mL-1。

2.4 RT-PCR鑒定結果

瓊脂糖凝膠電泳結果表明，利用RT-PCR方法擴增出大小與預計結果一致的片段434 bp（圖3）。將測得的序列與Gen Bank 數據庫中已知序列進行比對及相似性分析，結果表明，此分離病毒為PRRSV。

3 結論與討論

細胞分離、鑒定時PRRSV是最常用、也是最準確的診斷方法之一。PRRSV分離主要使用低成本的傳代細胞如Marc-145細胞、豬肺泡巨噬細胞PAM[2]、CL2621細胞[9]。根據PRRSV分離株不同細胞嗜性也不同[10-11]。PRRSV更偏愛在PAM上復制，且親嗜性最高，但是PAM制備技術難度較大，CL2621細胞是專利細胞。目前對PRRSV既敏感又方便的細胞為Marc-145和從Marc-145中克隆出的HS2H細胞。有實驗證明，PRRSV新疆分離株適宜在Marc-145細胞上生長[12]，并從中分離到病毒，故本研究采用Marc-145細胞進行PRRSV的分離培養，同時也證實了新疆地區分離株在Marc-145細胞上培養有很好的增殖并能產生典型的CPE。

對PRRSV的檢測方法很多，包括血清中和試驗（SN）、核酸探針雜交技術、間接免疫熒光抗體試驗（IFA）、過氧化酶單層試驗（IPMA）、膠體金抗體檢測技術（GIA）、乳膠凝集試驗（LAT）、RT-PCR及重組蛋白分子診斷技術[13-14]等。實驗室檢測方法有：病毒的分離（VI），間接免疫熒光（IFA），血清中和試驗（SVN），ELISA，RT-PCR等。豬繁殖與呼吸綜合征的檢測方法眾多，各有優點，其中病毒的分離、免疫熒光抗體染色法和免疫過氧化物酶染色法等均需細胞培養才行，因工作量大、周期長，故不利于在基層推廣應用。而過氧化物酶單層試驗需要大量豬肺泡巨噬細胞，同間接免疫熒光試驗一樣，在檢測時會因為操作活毒而產生實驗室安全隱患，并且過氧化物酶單層試驗與間接免疫熒光試驗不適合大范圍檢測，RT-PCR方法則相對快速、簡便、特異性強。ELISA和IFA在眾多檢測PRRSV的方法中，步驟較為繁瑣，不適合快速診斷，而RT-PCR可快速鑒別診斷PRRSV，故本試驗采用RT-PCR方法進行分離病毒的檢測。

本研究分離國內新疆毒株，選用Marc-145細胞進行分離培養，連續傳代，盲傳3代即產生明顯的細胞病變。根據分離病毒毒株致Marc-145的CPE、毒價滴定、RT-PCR反應以及與GenBank上登陸的基因序列對比，證實所分離的病毒為PRRSV，與有關文獻報道一致[15]，成功地從組織病料中分離得到豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），將其命名為PRRSV新疆株（XJ-Q）。細胞出現CPE后取其感染物，從中提取RNA并通過PCR法鑒定，結果與預期相符，從而實現了對所獲得分離培養物進行快速、確切的鑒定。成功分離獲得的新疆分離株將為新疆PRRSV基因遺傳變異分析的研究奠定基礎。

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