冷脅迫對黃瓜CBF1基因沉默植株相關耐冷指標的影響

于錫宏 ，戴忠仁 ，2，蔣欣梅 ，董然

（1.東北農業大學園藝學院寒地蔬菜生物學重點實驗室/蔬菜生產設施工程與環境實驗室，哈爾濱，150070；2.哈爾濱市農業科學院）

黃瓜（Cucumis sativusL.）是典型的冷敏感型植物，其所有組織以及果實器官都對低溫敏感，通常溫度在10～12℃以下時其生理活動失調、生長減緩或停止發育，5℃以下則難以適應[1]。黑龍江省位于高緯度地區，春秋季節易遭受寒流的侵襲，冷害多發，而作為我省冬春設施反季節生產的主栽蔬菜之一，冷敏感性已經成為黃瓜正常生長的主要限制因子。因此，研究黃瓜的冷脅迫機理，一直是科研工作者孜孜不倦的追求。

本試驗以黃瓜CBF1基因沉默植株為試材，研究了冷脅迫下黃瓜CBF1基因的沉默對植株相關耐冷指標的影響，通過對相對電導率和丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白以及葉綠素含量的分析，試圖研究黃瓜冷脅迫反應的生理機制，為改進低溫條件下黃瓜的栽培措施和研究黃瓜冷脅迫的生理機制提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 黃瓜沉默植株的獲得

根據CBF1基因編碼區的cDNA序列，設計帶有相應酶切位點的引物（正向引物序列：5'-ATCGATCCGATCAGCATGTCTCAACT-3；反向引物序列：5'-GTCGACAGTAACTCCAAAGCGACACG-3），以黃瓜cDNA為模板，PCR擴增目的片段，回收后克隆到pMD18-T載體，進行雙酶切定向克隆在pgR107載體的ClaI和SalI多克隆位點，構建pgR107-CBF1。以本實驗室保存黃瓜品種Y081無菌組培苗為試驗材料，將無菌苗移栽到營養缽中，轉到晝夜平均溫度18℃條件下的人工氣候箱中生長，用無菌注射器將農桿菌懸浮液壓入葉片葉脈中，獲得基因沉默植株。

1.2 試驗處理

將基因沉默后的植株（T）放置在平均溫度為18℃的條件下預處理1 d，然后置于晝夜平均溫度7.5℃的光照培養箱中冷脅迫處理3 d，為了消除光照培養箱內因弱光條件而引起的試驗誤差，我們把始終處于常溫條件下未經侵染處理的正常植株作為對照1（CK1），以采用相同方式進行冷處理的未經侵染處理的正常植株作為對照2（CK2）。隨機選取功能葉進行相關生理生化指標的測定，其中相對電導率測定采用外滲電導法[2]；丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸比色法[2]；脯氨酸含量測定采用酸性水合茚三酮比色法[3]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[3]；葉綠素含量測定采用丙酮比色法[2]。

2 結果與分析

2.1 冷脅迫對黃瓜CBF1基因沉默植株丙二醛、相對電導率和葉綠素含量的影響

如表1所示，與常溫條件下生長的對照CK1相比，經過冷脅迫后可以使植株葉片中的丙二醛含量和相對電導率顯著提高，而葉綠素含量顯著下降。其中，均以基因沉默植株的丙二醛含量和相對電導率表現最高，顯著高于CK1和CK2；而以基因沉默植株的葉綠素含量最低，顯著低于CK1和CK2。處理T中的丙二醛含量和相對電導率比CK2分別高10.96%和41.48%，葉綠素含量比CK2降低了42.37%。說明冷脅迫對基因沉默植株的傷害要重于對照植株，可能已給植株造成不可恢復的傷害，其細胞膜系統的正常代謝活動已遭到破壞。

2.2 冷脅迫對黃瓜CBF1基因沉默植株體內脯氨酸和可溶性蛋白質含量的影響

通過比較冷脅迫下基因沉默植株與對照植株之間脯氨酸和可溶性蛋白質含量的變化可以看出（表2），冷脅迫后黃瓜植株的脯氨酸和可溶性蛋白質含量均顯著增加，但與常溫對照CK1比，冷脅迫后基因沉默植株（T）體內脯氨酸和可溶性蛋白含量的增加幅度均低于CK2的增加幅度。

3 結論與討論

冷脅迫對植物的整個生理代謝過程均產生影響，包括細胞原生質體的流動減緩和停滯、細胞器結構的破壞、有機物的合成受阻和運輸緩慢，甚至植株干枯死亡等[4]。冷脅迫對植物造成傷害的一個重要方面是質膜相變引起的電解質外滲，而相對電導率是一個對低溫比較敏感的指標，而且簡便易測，能反映特定低溫下質膜的透性[5]，為大多數研究者所使用。同時膜脂過氧化的終極分解產物是丙二醛，其含量的多少可反映膜質過氧化的程度，也間接反映了生物體抗氧化能力的強弱，其含量越高，說明植株遭受逆境傷害的程度越嚴重。張學明[6]研究發現，植物體內的丙二醛含量可表征細胞膜的損傷程度，丙二醛含量越高，細胞膜的透性越大；劉建輝等[7]認為，冷脅迫后的冷敏型黃瓜相對電導率高于耐冷型黃瓜。在果樹上也有類似的報道，宋洪偉等[8]的研究表明，耐冷性強的懸鉤子屬、獼猴桃屬和醋栗屬的小漿果冷脅迫后膜脂不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比值及不飽和度均較高，細胞膜的穩定性相對較高；劉艷等[9]研究發現，耐冷性強的梨品種體內脂肪及脂類物質的積累顯著的高于不耐冷品種。植物的生長發育與植物體的光合作用緊密相關，低溫對光合作用的影響也最大，葉綠體是植物體進行光合作用的主要場所，對冷脅迫最為敏感[10]，王毅等[11]研究發現，冷脅迫后黃瓜幼苗葉片的葉綠素含量顯著降低，細胞正常代謝受影響；樊懷福等[12]發現冷脅迫后番茄的葉綠素和類胡蘿卜素含量降低。這與我們的研究相符，基因沉默植株的耐寒性明顯低于對照植株，沉默植株正常生理代謝受到抑制，體內相對電導率和丙二醛含量顯著增加，葉綠素含量顯著降低。

表1 冷脅迫對黃瓜CBF1基因沉默植株丙二醛、相對電導率和葉綠素含量的影響

表2 冷脅迫對黃瓜CBF1基因沉默植株脯氨酸和可溶性蛋白質含量的影響

冷脅迫下植物體內游離蛋白質含量和脯氨酸含量增加，可有利于細胞保水性的增加，降低細胞的結冰溫度，提高植物的耐冷性。有些學者研究發現，黃瓜冷脅迫期間，體內可溶性蛋白含量和耐冷性之間呈正相關的關系，林善枝等[13]的研究表明，冷脅迫過程中毛白楊幼苗蛋白質含量的增加與其耐冷性和存活率的增強密切相關。對于蛋白質與植物耐冷性的關系，也有學者提出了不同的觀點，簡令成[14]認為，植物體內可溶性蛋白質的增加與植物耐冷性的增強無明顯的因果關系，可溶性蛋白質含量在冷脅迫條件下無明顯變化；何若韞[15]研究發現，冷脅迫下稻米體內的可溶性蛋白含量降低，而游離氨基酸含量增加，與耐冷型品種相比，冷敏型品種的可溶性蛋白質更低。我們的試驗結果表明，冷脅迫后黃瓜CBF1基因沉默植株體內的脯氨酸和可溶性蛋白質含量增加的幅度遠遠低于未沉默植株增加幅度。

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