甲胎蛋白修飾的樹突狀細胞誘導抗肝癌免疫作用的研究

陳國梁

(金華市人民醫院，浙江 金華 321000)

樹突狀細胞(DC)是人體中功能最強的抗原呈遞細胞，可對抗原進行高效攝取、加工以及呈遞。甲胎蛋白(AFP)屬糖蛋白，源于胚胎肝臟細胞，待胎兒出生兩周后逐漸從血液中消失。最近有研究顯示原發性肝癌患者體內甲胎蛋白含量普遍較高，因此眾多科研工作者開始考慮甲胎蛋白用于肝癌患者進行生物治療。本研究采用甲胎蛋白修飾的樹突狀細胞誘導抗肝癌免疫，實驗結果良好，現報道如下。

一、材料與方法

(一)AFP修飾DC細胞的制備。

人肝癌細胞株BeL-7402購自中國科學院上海生科院細胞資源中心，將其制備為熱休克腫瘤細胞(Bel-7402)凍融抗原。選擇12例健康志愿者，年齡為21-43歲，平均年齡為(31.8±4.2)歲，均抽取其外周血 50-100mL，分別將其單個核細胞進行分離，采用10%的胎牛血清培養基進行細胞懸浮培養，培養溫度設置為37℃，含5%CO2貼壁2h之后，洗去非貼壁淋巴細胞，采用 GM-CSF(1000U/ml)和 IL-4(500U/ml)將其誘導為未成熟的DC，培養至第6天，將其分為兩組，對照組僅采用原先的GM-CSF和IL-4繼續培養，而觀察組加入AFP(甲胎蛋白)陽性的肝癌細胞株Bel-7402，即采用凍融抗原負載誘導。兩組均在誘導24h之后采集DCs，采用流式細胞儀對細胞表型進行分析，采用熒光標記觀察CD80、CD86以及HLA-DR等的表達情況。

(二)成熟DC誘導T淋巴細胞活化檢測。

對成熟DCs刺激 T淋巴細胞的活性進行檢測，采用ELISPOT試劑盒，對照組將誘導成熟DCs刺激誘導T細胞，而觀察組將AFP陽性的凍融抗原誘導成熟DCs去刺激誘導T細胞。兩組均在37℃和5%CO2中孵育24-48h，之后觀察釋放IFN-γ的激活T細胞數。

(三)成熟DC體外誘導特異性肝癌CTLs的檢測。

選擇12例HLA-A2陽性志愿者提取出的自體非貼壁細胞淋巴細胞作為目標效應細胞，按照1 10比例各加入對照組和觀察組誘導成功的成熟 DCs，培養5天后收獲，采用DimerX技術觀察兩組細胞中特異性抗肝癌CTLs的百分率。

(四)統計學分析。

采用SPSS 18.0軟件包進行數據分析，計量資料采用(±s)來表示，組間比較采用t檢驗，計數資料采用x2檢驗，當P＜0.05時，兩組之間的差異具有統計學意義。

二、結 果

本研究結果顯示觀察組誘導的 DCs成熟表型中CD80、CD86和HLA-DR的比率均顯著高于對照組，差異具有統計學意義(t=10.16、4.66、15.89，P ＜0.05)(見表 1)。

表1 觀察組和對照組的DCs成熟表型比率(%，±s，n=12)

表1 觀察組和對照組的DCs成熟表型比率(%，±s，n=12)

CD80 CD86 HLA-DR對照組組別05 8.19±4.13 54.29±5.12 23.22±4.52觀察組 32.33±7.12 65.16±6.25 58.24±6.15 t值 10.16 4.66 15.89 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.

ELISPOT檢測結果顯示，對照組中平均每105個T淋巴細胞可檢測到的分泌 IFN-γ的斑點數為(11.25±2.33)個，顯著低于觀察組，差異具有統計學意義(t=36.85，P＜0.05)。

本研究結果表明，觀察組中誘導CTLs結合表位肽A和表位肽B的陽性細胞數均顯著高于對照 組，差異具有統計學意義(t=16.58、12.54，P ＜ 0.05)(見表3)。

表2 兩組成熟DCs激活T細胞釋放IFN-γ的ELISPOT分析(個，±s)

表2 兩組成熟DCs激活T細胞釋放IFN-γ的ELISPOT分析(個，±s)

組別 份數 斑點數對照組12 11.25±2.33觀察組 12 101.62±8.17 t值 36.85 P 值 ＜0.05

表3 兩組成熟DCs誘導CTLs的表位肽-DimerX的檢測結果(%，±s)

表3 兩組成熟DCs誘導CTLs的表位肽-DimerX的檢測結果(%，±s)

組別 例數 表位肽A:DimerX 表位肽B:DimerX對照組 12 0.05±0.02 0.05±0.01觀察組 12 1.06±0.21 1.10±0.29 t值 16.58 12.54 P值 ＜0.05 ＜0.05

三、討 論

目前手術切除治療肝癌較為徹底，但手術治療后復發率高，尤以肝內復發最為顯著。即使術后采取化療措施，復發率仍不可小覷。DC屬抗原呈遞細胞，未成熟時遷移能力較強，而成熟后可激活初始T細胞，維持正常免疫應答。體內多數DC處于非成熟狀態，受抗原刺激后即分化為成熟DC，表達出高水平的粘附因子[1]。目前針對于 DC的抗腫瘤免疫治療潛力較大，已用于治療黑色素瘤、腎細胞瘤和前列腺癌等[2-3]。甲胎蛋白是一種胚性糖蛋白，正常人體內 AFP水平很低，但出現肝再生、妊娠、生殖系統癌變或者原發性肝癌時多數患者血清中AFP水平均升高，尤其是原發性肝癌患者，其AFP值升高者大約占80%左右。因此甲胎蛋白是診斷原發性肝癌的特異性指標。

本文表明甲胎蛋白修飾的DCs成熟表型中CD80、CD86和HLA-DR所占比率均顯著高于對照組(P＜0.05)，說明甲胎蛋白抗原誘導促使DC成熟，增強其呈遞抗原功能。ELISPOT檢測結果顯示，甲胎蛋白修飾的成熟DC誘導T淋巴細胞，平均每105個T淋巴細胞可檢測出分泌IFN-γ的斑點數顯著高于對照組(P＜0.05)。這是由于成熟 DCs表面有較多HSP受體，該受體能夠與T淋巴細胞相互作用，上調表面分子表達，提高IFN-γ分泌。本研究還發現甲胎蛋白修飾的成熟DCs誘導CTLs結合表位肽A和表位肽B的陽性細胞數均顯著高于對照組(P＜0.05)，表明甲胎蛋白修飾的成熟DCs可激發特異性抗肝癌免疫應答。綜上所述，甲胎蛋白修飾的樹突狀細胞在誘導抗肝癌免疫中療效較好，值得臨床推廣。

[1]史繼靜，王 昕，常瑞霞，等.腫瘤抗原特異性CTL細胞聯合樹突狀細胞治療原發性肝癌的安全性和有效性評價[J].中國實用醫刊，2013，40(24):93-95.

[2]岳玲玲，張連生，柴 曄，等.負載抗原的DC與CIK共培養對耐藥乳腺癌細胞的殺傷作用[J].中國腫瘤生物治療雜志，2012，19(4):437-441.

[3]章 燁，朱壽興，申小蘇，等.多肽負載DC聯合CIK治療激素難治性前列腺癌的療效[J].中國腫瘤生物治療雜志，2012，19(4):414-420.