大孔樹脂層析－酸性氧化鋁吸附法制備蛇床子素工藝研究

孫士青，史建國，馬耀宏，楊俊慧

(山東省科學院生物研究所，山東濟南250014)

蛇床子素(osthole)化學名為甲氧基歐芹酚或歐芹酚甲醚，是中藥蛇床子(Cnidium monnieri(L.)Cuss.)中含量最高的一種香豆素類有效成分?，F代藥理研究表明，蛇床子素具有抗高血壓、抗心律失常、抗骨質疏松、抗炎以及抗變態反應等功效［1］。

高純度蛇床子素(質量分數90%以上)的制備是研發一類創新藥物的必需物質基礎，目前報道的蛇床子素的提取可采用溶劑法、酸堿法、超聲法及超臨界萃取法等［2－4］。但是，能夠在工業生產中實際應用的提取方法主要是采用通用提取裝置的溶劑法。超聲法、超臨界萃取法都需要專用的提取設備，成本高、通用性差且維護保養難度大，難以大規模工業化應用。酸堿法對設備腐蝕性強、環境污染壓力大，屬于行業限制采用的提取法。分離蛇床子素主要有重結晶法、包結重結晶法以及色譜法等［5－7］，由于蛇床子素特殊的親酯性使得分離蛇床子素需采用的重結晶溶劑以及色譜洗脫溶劑多為氯仿、苯、甲醇和石油醚等有毒、有害、易燃和易爆試劑［2－3］。如果在藥品生產過程中使用以上試劑，不僅對環境安全、人員健康有嚴重危害，而且有毒試劑在所制備的藥品中的殘留量也將成為新藥審評中難以克服的問題。本文采用大孔樹脂層析結合酸性氧化鋁吸附法分離蛇床子素，僅用乙醇為提取溶劑，而將經過大孔樹脂除去了親脂性雜質的總香豆素類化合物吸附在酸性氧化鋁表面裝入索氏提取器中，再用原本對蛇床子素溶解性并不強、不適合作重結晶溶劑的乙酸乙酯連續回流洗脫，突出乙酸乙酯對吸附在酸性氧化鋁表面的蛇床子素的選擇性洗脫能力，巧妙地將提取裝置用于分離操作，從而實現只用乙醇與乙酸乙酯兩種低毒又經濟的試劑即可方便快捷地制備高純度蛇床子素，為蛇床子素的工業化開發提供了安全可行的工藝條件。

1 儀器與材料

LC-15高效液相色譜儀(島津);SPD-15C紫外可見檢測器(島津);蛇床子素對照品由國家藥品生物制品檢定所提供;蛇床子購自亳州藥材市場(供試藥材由山東省中醫藥研究院孫立立研究員鑒定);FL-1大孔吸附樹脂(天津歐瑞生物科技有限公司);乙醇、乙酸乙酯、氧化鋁均為化學純。

2 研究方法

2.1 色譜條件

色譜柱:島津 C-18柱(250 mm×4.6 mm);流動相:乙腈∶水 =70∶30，檢測波長:249 nm，流速:0.8 mL/min，理論塔板數:5 000，進樣量:20 μL。

2.2 標準曲線

精密稱取蛇床子素對照品加乙醇成100 μg/mL溶液作為對照品溶液，精密量取對照品溶液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0 μL分別注入液相色譜儀，以蛇床子素進樣量為橫坐標，吸收峰面積積分值為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程Y=308X+342，R=0.998，表明蛇床子素在0.28～1.10 μg范圍內與峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.3 藥材蛇床子中蛇床子素的含量測定

參照《中國藥典》藥材蛇床子“含量測定”項下要求操作［8］。

2.4 蛇床子素制備

蛇床子藥材分成不破碎、破粗粉、破細粉各100 g，分別加入體積分數為75%、85%、95%的乙醇回流提取3次，每次1 h。合并乙醇提取液于68℃減壓蒸餾回收乙醇，轉水液放置至室溫，濕法上樣1 kg FL-1大孔樹脂層析柱(柱直徑8 cm、柱床高度80 cm)。上樣后用水洗脫2個柱床、體積分數30%乙醇洗脫2個柱床，體積分數為80%的乙醇洗脫至洗脫液檢不出蛇床子素，減壓蒸餾回收體積分數為80%的乙醇洗脫液至無乙醇蒸餾液滴出。

取上述蒸除乙醇的蛇床子素水溶液分別拌入中性、酸性、堿性氧化鋁50 g，80℃烘干水分粉碎過60目篩，裝入濾紙筒置索氏提取器中加乙酸乙酯500 mL浸泡過夜，連續回流洗脫10 h，洗脫液蒸餾回收溶劑至過飽和狀態，放置析出白色蛇床子素結晶，經HPLC測定質量分數在95%以上。

蛇床子素得率(%)=(制得蛇床子素總量/藥材蛇床子素量)×100%。

制得蛇床子素總量=(產品中蛇床子素測得量/測定稱樣量)×制得物總量。

2.5 正交試驗優化工藝

采用L9(34)正交表考察乙醇濃度、藥材粉碎度、氧化鋁酸堿性對蛇床子素得率的影響，設計正交試驗因素水平表(表1)。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal experiment design

3 結果與討論

3.1 供試蛇床子藥材中蛇床子素含量測定結果

3份平行樣品測定結果(質量分數)分別為1.21%、1.24%、1.25%，平均含量1.23%，符合《中國藥典》“含量不低于1%”的要求。

3.2 正交試驗結果

根據表1的設計測定不同影響因素(A、B、C)以及不同水平對應的純化產品中蛇床子素含量，計算蛇床子素得率(表2)。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal experiment results

由表2分析知，上述因子影響蛇床子素得率的程度依次為:A＞B＞C，乙醇濃度對蛇床子素提取得率影響最大，最佳工藝組合為A3B2C1，即加入體積分數95%乙醇于粉碎成粗粉的蛇床子中回流提取，提取液回收溶劑轉水液上大孔樹脂柱，大孔柱體積分數80%乙醇洗脫液回收溶劑后拌酸性氧化鋁烘干后，再用乙酸乙酯回流洗脫，乙酸乙酯洗脫液回收溶劑至過飽和狀態放置析晶，此工藝蛇床子素得率最高。

乙酸乙酯在連續回流條件下可以選擇性地洗脫吸附在酸性氧化鋁表面的蛇床子素，洗脫液回收溶劑至過飽和狀態后便可析出高純度蛇床子素，相比重結晶法可以大大減少有機溶劑用量，提高工業化生產過程的安全性、降低生產成本;而與色譜法分離蛇床子素工藝比較，本文方法可以減少操作環節、增加樣品處理量和產品中蛇床子素的均一性。

蛇床子素在氧化鋁表面的吸附性能與洗脫性能目前未見報道，所以相關基礎研究薄弱，氧化鋁的粒度、晶型、含水量對蛇床子素吸附與洗脫的影響、結晶母液中的蛇床子素的回收利用等都是下一步研究的重點。

［1］閆俊，宣衛東，卞俊.蛇床子素研究進展［J］.中國藥業，2012，21(11):110-112.

［2］曾春萍，賈曼譜，王書華，等.蛇床子素制備方法研究［J］.中草藥，2011，42(9):1740-1742.

［3］典靈輝，吳鐵，崔燎.蛇床子二氧化碳超臨界萃取物中有效成分的含量測定［J］.時珍國醫國藥，2009，20(4):853-854.

［4］王銳，楊婧，謝國梁，等.超聲法聯合表面活性劑提取蛇床子中蛇床子素的研究［J］.時珍國醫國藥，2013，24(3):603-604.

［5］秦路平，張巧艷，陳遠平，等.蛇床子素晶體及制備方法:中國，CN200610052269.X［P］.2006-12-13.

［6］王徐強，管文佳.一種蛇床子素的制備方法:中國，CN201010531931.6［P］.2011-02-16.

［7］張學農，貝永燕，王周麗.可溶性蛇床子素包含物、分散片及其制備方法:中國，CN201110289546.X［P］.2012-01-11.

［8］國家藥典委員會.中華人民共和國國藥典2010年版一部［M］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:295.