胰島β細胞破壞的斑馬魚模型建立

夏 銘 潘 雪(貴陽中醫學院，貴陽 貴州 550002)

糖尿病是以糖代謝紊亂為主要表現的內分泌疾病，源于糖的來源與去路失去了動態的平衡，導致胰腺功能障礙，胰島素分泌減少。胰島素由胰島β細胞合成和分泌，經血循環到達體內各組織器官的靶細胞，與特異受體結合并引發細胞內物質代謝效應。關注胰島β細胞的保護和再生作用的研究成為目前糖尿病防治工作的重點方向。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 構建生殖系穩定整合目的基因的轉基因斑馬魚系F2代。進入北京愛生斑馬魚全自動養殖系統，按照Westerfield〔1〕方法喂養4 w后進行規律交配訓練，以質量穩定的胚胎作為實驗對象。

1.2 實驗試劑 限制性內切酶、T4連接酶、E.coli DH5α感受態、凝膠純化試劑盒、質粒小規模抽提試劑盒購自Takra公司;In Situ Cell Death Detection Kit、DIG標記試劑盒購自Roche公司;SP6 RNA polymerase、T7 RNA polymerase、T3 RNA polymerase、RNA柱純化試劑盒購自Ambion公司;levamisol、甲硝唑購自Sigma公司。Western Blotting Chemiluminescence Luminol Reagent購自Santa Cruz公司。其他的常規生化及分子生物學試劑均購自上海生工生物工程公司。

1.3 主要實驗儀器 斑馬魚養殖系統(北京ESEN Environ Science)、生化培養箱(青島Hair)、梯度PCR儀和臺式冷凍離心機(德國Eppendorf)、多功能電泳儀及水平電泳槽和UVP凝膠成像儀(上海復日科技)、雜交爐(美國Boekel)、蔡斯體視熒光顯微鏡及顯微攝像系統(德國ZEISS Stereo Discovery.V20)。

1.4 全胚胎原位雜交(WISH)分別以構建好的斑馬魚胰島素cDNA和GFP-PCS2+重組質粒作為模版，體外轉錄合成地高辛標記的反義mRNA探針;收集固定INS-nfsB-tg系F2代轉基因斑馬魚胚胎，脫水后復水化處理，分別以胰島素和綠色熒光蛋白(GFP)的mRNA探針于雜交緩沖液65℃雜交過夜。斑馬魚胚胎在封閉液中封閉1～3 h。然后加入抗地高辛抗體4℃處理過夜。之后用BCIP/NBT溶液處理胚胎30～60 min，顯微鏡下觀察顯色情況，然后用1 ml磷酸鹽緩沖液(PBST)3次快速漂洗終止顯色反應。當熒光蛋白與內源性胰島素表達共定位，可證實綠色熒光蛋白對胰島β細胞可靠的示蹤性。

1.5 Western印跡技術 取20個斑馬魚胚胎于1.5 ml Eppendorf管中，去卵黃囊緩沖液(55 mmol/L NaCl，1.8 mmol/L KCl，1.25 mmol/L NaHCO3)，分離斑馬魚胚胎的卵黃囊，反復清洗2次后加入RIPA裂解液和PMSF超聲裂解，酶標儀定量。取等量蛋白樣品加等體積的上樣緩沖液煮沸10 min，10%SDSPAGE電泳進行條帶分離，SDS-PAG凝膠上的蛋白在 Mini Trans-Blot Cell(BioRad)中電轉移到硝酸纖維素膜(OPTITRAN BA-S，Schleicher＆ Schuell，Keene，NH，USA)。封閉液 4℃封閉過夜，加入一抗，室溫孵育1 h，PBST清洗后，加入二抗，室溫孵育1 h，按試劑說明書用Western Blotting Chemiluminescence Luminol Reagent進行化學發光顯影，并用X光片記錄影像。為了檢測活體熒光蛋白表達效率，通過Western印跡技術檢測內源綠色蛋白的表達水平來測定甲硝唑破壞胰島β細胞的效率。

1.6 免疫熒光 收集胚胎用4%多聚甲醛4℃固定過夜。胚胎進行脫水和復水，-20℃的甲醇過夜。-20℃預冷丙酮處理10 min，PBST清洗胚胎，TritonX-100室溫透化30 min，阻滯液室溫封閉1 h，加入特異性一抗4℃孵育過夜，PBST室溫清洗3次后加入二抗，室溫孵育1 h，去除二抗，PBST清洗降低背景，Tunnel反應液37℃孵育2 h，PBST清洗2次，熒光顯微鏡下觀察結果。采用全胚胎免疫熒光的方法檢測甲硝唑作用后綠色熒光蛋白表達效率明顯降低。同時運用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡情況。

2 結果

2.1 化學方法破壞胰島β細胞 通過顯微注射將轉基因構件注入斑馬魚體內，篩選并獲得可以穩定遺傳的表達綠色熒光蛋白的胰島β細胞的F2代轉基因斑馬魚系(圖1a)。運用INS探針和GFP探針，通過全胚胎原位雜交實驗證實了綠色熒光蛋白與胰島β細胞表型共定位(圖1b)。Mt2孵育48 h后可見活體熒光蛋白表達量明顯降低，同時胚胎發育情況和甲硝唑對胚胎的毒性沒有明顯影響(圖1c)。

2.2 Western印跡技術證實胰島β細胞的破壞效果 熒光顯微鏡下選取甲硝唑化學破壞48 h后的胚胎，綠色熒光蛋白表達明顯減低的活體胚胎，熒光蛋白表達效率同時減低，且未在野生型組檢測到熒光蛋白的表達。該結果證實了甲硝唑確實能靶向破壞胰島β細胞，并能夠通過活體熒光觀察方便地識別(圖2)。

2.3 全胚胎免疫熒光檢測 甲硝唑組GFP熒光蛋白明顯降低同時，細胞的凋亡也比對照組明顯增多(圖3)。

圖1 化學方法破壞胰島β細胞

圖2 Western印跡技術檢測熒光蛋白表達效率

圖3 全胚胎免疫熒光檢測綠色熒光蛋白表達

3 討論

轉基因技術為人類疾病動物模型研究提供了一種新的方法〔2〕，通過人為改造動物基因組，能在活體水平上研究人類疾病基本發生的分子機制、組織病理狀況、治療的效果等，目前應用于現代生物學的各個方面。

研究利用斑馬魚這一模式生物〔3〕，因其常年產卵，一次交配能獲得數百個胚胎，胚胎在體外受精，發育早期呈透明，易于操作，發育過程可被直接連續觀察，方便進行大規模的化學突變型篩選，定位克隆和活體候選藥物篩選等諸多優勢。前期研究中，通過顯微注射的方法，將轉基因構件整合至斑馬魚基因組中，構建了特異性標記胰島β細胞為“綠色”細胞的胰島β細胞轉基因斑馬魚系。在轉基因斑馬魚的胚胎養殖水中加入甲硝唑，通過硝基還原酶還原甲硝唑的硝基成一種細胞毒成分〔4〕，既不影響胚胎發育，也不會引起胚胎過度畸形和大量死亡，同時隨著基因的表達，這種細胞毒性可以靶向性作用于細胞的DNA代謝過程，抑制細胞的脫氧核糖核酸的合成，干擾細胞的生長、繁殖，最終導致細胞死亡，獲得一種化學遺傳學破壞胰島β細胞的活體斑馬魚疾病模型。

不同類型糖尿病的病因不盡相同，胰島β細胞不同程度破壞的核心病機引起了廣泛關注。更多研究集中在保護、再生和移植胰島β細胞〔5，6〕，期望可以獲得糖尿病治療的有效方法。

1 Westerfield M.The zebrafish book:a guide for the laboratory use of Zebrafish(Danio rerio)〔M〕.Eugene:University of Oregon Press，1995:56-60.

2 Wadsworth JD，Asante EA，Collinge J.Contribution of transgenic models to understanding human prion disease〔J〕.Neuropathol Appl Neurobiol，2010;36(7):576-97.

3 Jorqens K，Hillebrands JL，Hammes HP，et al.Zebrafish:a model for understanding diabetic complications〔J〕.Exp Clin Endocrinol Diabetes，2012;120(4):186-7.

4 Pisharath H，Parsons MJ.Nitroreductase-mediated cell ablation in transgenic zebrafish embryos〔J〕.MethodsMol Biol，2009;546:133-43.

5 Stendahl JC，Kaufman DB，Stupp SI.Extracellular matrix in pancreatic islets:relevance to scaffold design and transplantation〔J〕.Cell Transplant，2009;18(1):1-12.

6 Cantarelli E，Citro A，Marzorati S，et al.Murine animal models for preclinical islet transplantation:no model fits all(research purposes)〔J〕.Islets，2013;5(2):79-86.