肝細胞肝癌中SALL4蛋白表達及其臨床病理意義

馬從乾 王 雅 趙 星 楊 軻 (南陽市中心醫院血管外科，河南 南陽 473000)

肝細胞癌(HCC)是世界最常見的惡性腫瘤之一，近年來手術切除治療HCC的效果并沒有取得明顯進展，易發生肝內外轉移，預后較差，HCC發生、發展的分子生物學機制仍有待進一步研究〔1〕。婆羅雙樹樣基因4(SALL4)是一種新發現的原癌基因，具有C2H2鋅指結構的蛋白轉錄因子，在維持胚胎干細胞功能方面起著重要作用。SALL4基因突變常常導致畸形或腫瘤的發生，其在急性髓系白血病、生殖細胞腫瘤、骨髓增生異常綜合征和肝樣胃癌中表達增高。本實驗通過蛋白免疫印跡方法檢測SALL4蛋白在HCC中的表達情況，并分析其臨床意義。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 收集2010年1月至2013年1月我院普外科手術切除的肝癌30例，病理檢測確定為HCC，并取相應的癌旁組織30例作為對照。其中男25例，女5例;年齡28～65〔平均(56.5±8.9)〕歲。有乙肝25例，無乙肝5例。按照肝癌的臨床病理分級(Sugihala分級)高分化癌12例，中分化癌8例，低分化癌10例。腫瘤直徑≤5 cm 19例，＞5 cm 11例。甲胎蛋白(AFP)≤400 μg/L 12 例，＞400 μg/L 18 例。腫瘤有包膜14 例，無包膜16例。門靜脈有癌栓8例，無癌栓22例。

1.2 主要試劑 一抗兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(SALL4)多克隆抗體(Santa Cruz)，一抗兔抗人GAPDH多克隆抗體(康為世紀)，二抗山羊抗兔IgG標記辣根過氧化物酶(HRP)購于康為世紀公司，SuperSignal West Pico化學發光底物(Thermo Scientific)，RIPA裂解液購于康為世紀，二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天公司。

1.3 蛋白免疫印跡 取組織100 mg，按照RIPA裂解液說明書進行操作，提取組織蛋白;使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定新提取的蛋白濃度;加入十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液，煮沸5 min;制備10%的SDS-聚丙烯酰胺分離膠，每個泳道加入20 μg蛋白，進行電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，加入一抗兔抗人SALL4多克隆抗體(1∶1 000)和一抗兔抗人GAPDH多克隆抗體(1∶5 000)4℃過夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，加入二抗山羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，最后加入發光液孵育5 min，進暗室膠片曝光。

1.4 統計學分析 應用SPSS10.0軟件。樣本率的比較采用χ2檢驗及配對四格表的χ2檢驗，蛋白表達采用非參數檢驗。

2 結果

2.1 肝癌中SALL4蛋白表達水平 90%的肝癌組織中SALL4蛋白表達水平顯著高于癌旁組織。見圖1。

圖1 蛋白免疫印跡檢測SALL4在肝癌組織和癌旁組織中的蛋白表達

2.2 肝癌中SALL4蛋白表達水平與臨床病理特征的關系 肝癌組織中SALL4蛋白表達水平與性別、年齡、腫瘤大小、乙肝、病理分級、腫瘤包膜和門脈癌栓差異均無顯著性，而與AFP有關。見表1。

表1 肝癌中SALL4蛋白表達水平與臨床病理特征的關系

3 討論

SALL基因是果蠅Spalt的同源異型基因具有高度保守性，目前包括SALL1、SALL2、SALL3和SALL4，屬于C2H2型鋅指轉錄因子〔2〕。SALL4是一種新發現的原癌基因。研究〔3〕發現LEF1和TCF4F能有效激活SALL4轉錄，從而激活經典的Wnt信號轉導通路，e-myc、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、基質金屬蛋白酶7(MMP-7)為Wnt信號的靶基因在腫瘤發生、發展過程中起重要的作用，提示SALL4基因具有導致腫瘤發生的潛能。同時SALL4具有維持干細胞特性的作用和致瘤的潛能。在白血病的研究中證實，SALL4至少通過與組蛋白脫乙酰酶(HDAC)的反應，來抑制PTEN，從而促進白血病的進展;通過活性肽來競爭SALL4與HDAC的反應，能解除SALL4對PTEN的抑制，導致SALL4高表達惡性腫瘤細胞的死亡;體內外實驗均證實這種活性肽具有抗白血病的作用〔4〕。因此，以SALL4為靶點治療腫瘤具有很好的前景。

在乳腺癌中，86.1%(31/36)的腫瘤組織中SALL4 mRNA高表達，但與臨床病理特征沒有明顯相關，盡管如此在乳腺癌進展的早期階段SALL4 mRNA表達較高;體外實驗中，siRNA干擾SALL4表達，可抑制乳腺癌細胞系(MCF7)細胞的增殖，導致細胞周期停止在G1期〔5〕。在肺癌中，93%的腫瘤組織中SALL4 mRNA高表達，跟乳腺癌中的作用相似〔6〕。在胃癌中，SALL4表達增高，同時跟淋巴結轉移相關;增高SALL4表達，可增強人胃癌細胞的增殖和遷移;siRNA敲低SALL4，可降低人胃癌細胞的增殖和遷移能力;SALL4過表達可誘導胃癌細胞的上皮間充質轉換;SALL4可通過誘導Bmi-1和Lin28B，促使胃癌細胞獲得干性〔7〕。SALL4基因可被檢測，并且具有高敏感性和特異性，所以對于惡性腫瘤的診斷、評價預后和治療中有很大的價值。

SALL4是胚胎干細胞維持多能性和自我更新的關鍵因子。在鼠類的肝臟中，SALL4的表達隨著長大而逐漸減低，成年后就沉默了;這提示SALL4促進胎兒期肝臟從早期發育到中期的重要作用〔8〕。HCC類祖細胞亞型通常認為有較差的預后。本文發現SALL4的蛋白表達在HCC中增高〔9〕。推測肝細胞中SALL4的重新表達是正常肝細胞向癌細胞轉變的標志，或肝癌干細胞的SALL4表達促進HCC形成。

雖然SALL4是最新研究發現的致癌基因，但對于其功能和引起肝細胞癌發生機制的研究目前還處于起步階段，仍需要進行更多的實驗以證實。SALL4在HCC干細胞上的異常表達提示與HCC的發生密切相關，深入地研究SALL4基因功能將有助于闡明HCC的發病機制，進而為今后更準確地診斷和靶向治療HCC提供一條新的途徑。

1 Ferlay J，Shin HR，Bray F，et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008:GLOBOCAN 2008〔J〕.Int J Cancer，2010;127(12):2893-917.

2 Zhang J，Tam WL，Tong GQ，et al.SALL4 modulates embryonic stem cell pluripotency and early embryonic development by the transcriptional regulation of Pou5f1〔J〕.Nat Cell Biol，2006;8(10):1114-23.

3 Bohm J，Sustmann C，Wilhelm C，et al.SALL4 is directly activated by TCF/LEF in the canonical Wnt signaling pathway〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2006;348(3):898-907.

4 Gao C，Dimitrov T，Yong KJ，et al.Targeting transcription factor SALL4 in acute myeloid leukemia by interrupting its interaction with an epigenetic complex〔J〕.Blood，2013;121(8):1413-21.

5 Kobayashi D，Kuribayshi K，Tanaka M，et al.SALL4 is essential for cancer cell proliferation and is overexpressed at early clinical stages in breast cancer〔J〕.Int J Oncol，2011;38(4):933-9.

6 Kobayashi D，Kuribayashi K，Tanaka M，et al.Overexpression of SALL4 in lung cancer and its importance in cell proliferation〔J〕.Oncol Rep，2011;26(4):965-70.

7 Zhang L，Xu Z，Xu X，et al.SALL4，a novel marker for human gastric carcinogenesis and metastasis〔J〕.Oncogene，2013;4:95.

8 Oikawa T，Kamiya A，Kakinuma S，et al.SALL4 regulates cell fate decision in fetal hepatic stem/progenitor cells〔J〕.Gastroenterology，2009;136(3):1000-11.

9 Lee JS，Heo J，Libbrecht L，et al.A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells〔J〕.Nat Med，2006;12(4):410-6.