hnRNP H與子宮內膜癌化療敏感性的相關性

趙向寨 王 璟 盧慶玲 李 萍 郭 影 (河北醫科大學第三醫院，河北 石家莊 05005)

子宮內膜癌是圍絕經及絕經后婦女常見生殖道腫瘤之一，近年全球發病率逐年上升。在我國，子宮內膜癌的發病率也呈上升趨勢。核不均一核糖核蛋白家族(hnRNPs)，參與多種疾病發生發展過程，尤其與腫瘤關系密切，沉默hnRNP A2B1基因抑制癌癥細胞生長已經在多種類型癌癥中得到證實〔1〕，但與hnRNP A/B亞族功能相似的hnRNP F/H亞族的研究相對較少。本文擬研究hnRNP H在子宮內膜癌組織及細胞中的表達及沉默hnRNP H基因對子宮內膜癌Ishikawa細胞紫杉醇化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 標本 標本來源于2010年1月至2012年1月就診我院婦科、初診病理提示子宮內膜癌患者59例，未給予先期放、化療，手術切除留取子宮內膜腺癌蠟塊標本。年齡(47.28±5.71)歲，病理證實均為子宮內膜腺癌，癌旁組織均證實無癌細胞浸潤。所有病理切片均由2位高年資病理科醫師復查。人子宮內膜癌細胞株Ishikawa購于中國科學院上海細胞庫，DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶購自GIBCO公司;hnRNP H抗體、hnRNP H siRNA、Control siRNA-A、siRNA轉染試劑購自 Santa Cruz公司;紫杉醇注射液購自海口市制藥廠有限公司、免疫組化試劑盒及凋亡Caspase 3/9、Bax、Bcl-2抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 SP法檢測組織中hnRNP H表達 采用免疫組織化學SP法，工作濃度為1∶100。石蠟組織5 μm連續切片，切片脫蠟水化，抗原修復，3%H2O2甲醇滅活內源性過氧化物酶活性，依次滴加一抗、二抗，DAB顯色，蘇木精復染，常規脫水、透明、封片，檢測hnRNP H表達情況，用已有陽性切片作為陽性對照，用PBS取代一抗作為陰性對照。結果判定:染色陽性的細胞質和(或)核呈棕黃色顆粒。采用image-plus圖像分析系統，每一切片400倍下隨機選取5個視野計算每一切片的平均光密度，進而得出該組陽性細胞的平均光密度值。未出現黃色或棕色顆粒為陰性表達。

1.2.2 細胞培養 Ishikawa細胞株經10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素 DMEM 培養基培養，37℃、5%CO2飽和度和濕度恒溫培養箱中孵育。0.25%胰蛋白酶消化細胞傳代，取對數生長期細胞。胰酶消化細胞計數，稀釋細胞，使得細胞密度為4×105個/ml，鋪于無菌6孔培養板中，培養12 h至Ishikawa細胞融合率達50%，棄去原細胞培養液，換無血清DMEM培養液，按轉染試劑盒說明書要求用Transfection regent稀釋 hnRNP H siRNA、Control siRNA及轉染試劑Transfection medium/regent。實驗分組:正常培養Ishikawa細胞組(con)、轉染hnRNP H siRNA細胞組、轉染Control siRNA細胞株。轉染試劑作用6 h，無血清培養基沖洗細胞，換含血清、抗生素培養基繼續培養。于轉染24 h后，分別搜集細胞提取總RNA及總蛋白待測。

1.2.3 實時定量(Real-time)PCR檢測hnRNP H RNA表達轉染后24 h，提取總 RNA，測定 A260/A280 值介于 1.8 ～2.0。以β-actin作為內參，總RNA濃度為1 mg/ml進行逆轉錄，將cDNA為模版進行PCR反應，PCR反應條件:預變性95℃ 10 s，95℃ 5s，60℃ 30 s，目的基因30個循環，內參循環數設定為25個循環。擴增完畢，分析溶解曲線，以β-actin為內參，利用CT值計算各組hnRNP H mRNA相對值。hnRNP H引物序列:5'-TGCCAAATATGAATAACGACCCA-3'，5'-GAGAAAAGTGCTCGTCACTGT-3';內參引物序列5'-GGTCCTACGTTCACCAACACA-3'，5'-CTCTGGGTCACATGGCTCT-3'。

1.2.4 Western印跡法檢測hnRNP H蛋白表達 轉染24 h，提取各組細胞，預冷PBS洗滌，于冰上進行操作，細胞裂解液裂解細胞，提取蛋白，BCA法蛋白定量，各組取等量細胞總蛋白于12%SDS-PAGE電泳分離蛋白，半干法轉至NC膜，含5%脫脂奶粉 TBS室溫封閉1 h，一抗 hnRNP H(鼠抗1∶200，SANTA CRUZ)和 GAPDH(兔抗1∶2 000，Abcam)，4℃過夜;二抗(羊抗鼠或羊抗兔1∶5 000)37℃ 1 h;ECL顯影，凝膠成像系統掃描。

1.2.5 四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測紫杉醇對Ishikawa細胞存活率的影響 將呈對數期生長的Ishikawa細胞計數，以5×103/ml、100 μl/孔接種于 96 孔板，于 37℃、5%CO2恒溫無菌培養箱中繼續培養，12 h細胞融合達70%，分別加入不同濃度紫杉醇(5、10、20、50 mg/L)，各設 3 個復孔，繼續培養 24 h，每孔加入濃度為5 mg/ml MTT 10 μl，繼續培養4 h，棄去培養液后每孔加入二甲基亞砜150 μl，微量振蕩器振蕩30 min，酶標儀測定各孔的吸光度A值(A570)及細胞存活率。

1.2.6 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率 將呈對數生長期的Ishikawa細胞1×104/ml接種于6孔板中培養，細胞生長狀態良好，不同組(對照組、紫杉醇組、siRNA組、紫杉醇+siRNA組)加入紫杉醇繼續培養24 h，收集并制成細胞懸液，70%冷乙醇固定，4℃儲存過夜。預冷 PBS洗滌，加入 PI、RNase，避光染色30 min，PI染色流式細胞儀檢測凋亡率。

1.2.7 Western印跡檢測各組細胞凋亡蛋白(Caspase 3/9 Bcl-2、Bax)的表達 將呈對數生長期的Ishikawa細胞1×104/ml接種于6孔板中培養，細胞生長狀態良好，經轉染及化療藥物作用后(處理方法同上)，于冰上在細胞中加入細胞裂解液裂解細胞，提取蛋白，蛋白定量，各組取等量細胞總蛋白于12%SDSPAGE電泳分離蛋白，半干法轉至NC膜，含5%脫脂奶粉TBS室溫封閉1 h，分別加一抗Caspase 3/9(Caspase 3/9鼠抗1∶500)、Bcl-2(鼠抗1∶250)、Bax(鼠抗 1 ∶1 000)和 GAPDH(兔抗1∶2 000，Abcam)，4℃ 過夜;二抗(羊抗鼠或羊抗兔 1 ∶5 000)37℃ 1 h;ECL顯影，凝膠成像系統掃描。

1.3 統計學方法 采用SPSS17.0軟件行χ2檢驗。兩組均數比較用成組t檢驗，多樣本均數比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 hnRNP H基因在子宮內膜癌組織中的表達 免疫組化結果顯示:子宮內膜癌組織中hnRNP H呈現高表達，顯著高于癌旁正常組織，經Image-plus圖像分析系統分析兩組IOD值學存在顯著差異(P＜0.05)。見圖1。

圖1 hn RNP H基因在子宮內膜癌及癌旁組織中的表達(×400)

圖2 Western印跡檢測hnRNP H蛋白表達

2.2 hnRNP H mRNA及蛋白表達 Real-time PCR及Western印跡檢測，hnRNP H mRNA及蛋白在siRNA干擾組表達均明顯下調，與Con及陰性對照(Mock)相比有顯著差異(P＜0.05)，從而證明siRNA敲低基因表達有效，敲低效率近70%左右。見圖2。

2.3 MTT檢測紫杉醇對Ishikawa細胞存活率的影響 紫杉醇在20 μg/ml，細胞生存近53%，接近半數抑制率，有此確定藥物作用濃度20 μg/ml，整體看來，紫杉醇可以降低Ishikawa細胞活性(P＜0.05)。

2.4 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率的變化 紫杉醇聯合siRNA組細胞凋亡率(45.03%)較高于對照組(3.07%)、紫杉醇組(29.16%)、siRNA 組(34.72)P＜0.05)，見圖 3。

2.5 各細胞 Caspase-3/9、Bcl-2、Bax的表達變化 Caspase-9/3、Bax表達在紫杉醇+siRNA組均顯著上調，與對照組、紫杉醇組及siRNA組相比有統計學差異(P＜0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2在紫杉醇+siRNA組表達明顯下調，與對照組、紫杉醇組及siRNA組相比有統計學差異(P＜0.05)，見圖4。

圖3 流式細胞代檢測各組細胞凋亡率

圖4 Western印跡檢測各組細胞Caspase-3/9、Bcl-2、Bax 的表達

3 討論

化療是治療子宮內膜癌的主要手段。提高腫瘤細胞對化療藥物敏感性，減少耐藥的發生，將提高子宮內膜癌患者生存率、改善生活質量。hnRNP家族是由蛋白質小分子組成的復合體，為核內RNA結合蛋白，參與RNA轉錄、外顯子剪接、選擇剪接位點、參與 pre-mRNA 的成熟、降解〔1〕，與腫瘤的發生、發展密切相關。hnRNP A2/B1結合至端粒單鏈，激活端粒酶，可作為癌癥的早期診斷指標〔2，3〕。基因水平靶標治療是針對癌癥的新方法，提高腫瘤對化療藥的敏感性，增強化療藥物療效〔4〕。研究發現，多藥聯合化療有效率較單藥明顯提高，但多藥聯合毒副反應明顯增加〔5～7〕。因此，如何提高一線化療藥敏感性是眾多學者的研究重點。

本研究提示沉默hnRNP H后子宮內膜癌Ishikawa細胞凋亡率明顯增加，說明對紫杉醇敏感性明顯增加。Western印跡測定各組細胞 Caspase-3/9、Bcl-2、Bax的表達，提示 hnRNP H與子宮內膜癌細胞紫杉醇耐藥有密切關系，同時提示子宮內膜癌患者對紫杉醇耐藥可能是由于hnRNP H在子宮內膜癌組織中高表達。

本研究結果為子宮內膜癌耐藥機制提供了新的基礎依據，明確hnRNP H在子宮內膜癌組織及細胞中高表達，通過沉默hnRNP H基因能有效提高子宮內膜癌細胞對紫杉醇的敏感性，腫瘤細胞凋亡率增加，凋亡蛋白表達異常，為子宮內膜癌的治療提供了新的分子生物學指標。

1 Clower CV，Chatterjee D，Wang Z，et al.The alternative splicing repressors hnRNPA1/A2 and PTB influence pyruvate kinase isoform expression and cell metabolism〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2010;107(5):1894-9.

2 Guha M，Pan H，Fang JK，et al.Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 is a common transcriptional coactivator in the nuclear transcription response to mitochondrial respiratory stress〔J〕.Mol Biol Cell，2009;20:4107-19.

3 Nakajima H，Mizuta N，Sakaguchi K，et al.Enhancement of paclitaxelinduced apoptosis in HER2-over-expressing human breast cancer cells by a pertuzumab mimetic peptide，HRAP〔J〕.J Biosci Bioeng，2010;110(2):250-3.

4 Ren Y，Zhou X，Mei M，et al.MicroRNA-21 inhibitor sensitizes human glioblastoma cells U251(PTEN-mutant)and LN229(PTEN-wild type)to taxol〔J〕.BMC Cancer，2010;10:27.

5 Humber CE，Tiemey JF，Symonds RP，et al.Chemotherapy for advanced，recurrent or metastatic endometrial cancer:a systematic review of Cochrane collaboration〔J〕.Ann Oncol，2007;18(3):409-20.

6 沈曉燕，向 陽.子宮內膜癌化療進展〔J〕.國際婦產科學雜志，2010;37(6):436-9.

7 Moxley KM，McMeekin DS.Endometrial carcinoma:a review of chemotherapy，drug resistance，and the search for new agents〔J〕.Oncologist，2010;15(10):1026-33.