祁州漏蘆不同溶劑提取物對急性肝損傷模型小鼠的保護作用Δ

宋 昊，朱 璟，金梅花，陳麗艷，全吉淑（延邊大學醫學院，吉林延吉 133000）

祁州漏蘆[Rhaponticum uniflorum（L.）DC]（以下簡稱為“漏蘆”）為多年生草本，廣泛分布于我國東北及河北、內蒙古、陜西、甘肅等地區。漏蘆具有清熱解毒、排膿消腫、通乳的功能，主治乳腺炎、腮腺炎、風濕性關節炎、淋巴結核、痔瘡等[1]。研究表明，漏蘆具有抗氧化、抗衰老、抗炎、增強免疫及抗腫瘤等藥理作用[2-4]。本文將研究漏蘆不同溶劑提取物對對乙酰氨基酚（APAP）致小鼠急性肝損傷的干預作用，探討漏蘆的保肝作用機制，為漏蘆的開發利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

3-30K型離心機（德國Sigma公司）；S22PC型分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 藥材

漏蘆采自吉林省長白山，經延邊大學藥學院劉勇鎮教授鑒定為真品。

1.3 藥品與試劑

聯苯雙酯滴丸（北京協和藥廠，批號：20091024）；APAP（美國Sigma公司，批號：125K0112）；白蛋白（ALB）、丙二醛（MDA）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）、還原型谷胱甘肽（GSH）、Na+-K+-ATP酶（Na+-K+-ATPase）、Ca2+-Mg2+-ATP酶（Ca2+-Mg2+-ATPase）、蛋白測試盒均購于南京建成生物技術研究所。

1.4 動物

KM種小鼠60只，♀♂兼半，體質量20～24 g，由延邊大學實驗動物中心提供[實驗動物使用合格證號：SCXK（吉）2008-0005]。

2 方法

2.1 漏蘆各提取物的制備[4]

將漏蘆切碎后，用90%乙醇回流提取2 h，共3次，合并濾液，經減壓濃縮即得漏蘆乙醇粗提物，得率為8.7%。將乙醇粗提物加水溶解，用等體積乙酸乙酯和正丁醇萃取，得漏蘆正丁醇提取物和水提取物。

2.2 復制模型與分組、給藥

將60只小鼠隨機均分為6組，即正常對照（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組、漏蘆乙醇粗提物（200 mg/kg）組、漏蘆正丁醇提取物（200 mg/kg）組、漏蘆水提取物（200 mg/kg）組、聯苯雙酯（100 mg/kg）組。ig給藥，每天1次，連續7 d。末次給藥1 h后，小鼠一次性ipAPAP（300 mg/kg），以復制小鼠急性肝損傷模型。復制模型期間禁食，不禁水。

2.3 血清生化指標的檢測

復制模型16 h后，小鼠眼球取血，分離血清，檢測血清ALB含量和ALT、AST、ALP活性。

2.4 肝組織抗氧化指標及DNA損傷的檢測

常規方法制備肝勻漿和肝線粒體。肝組織用PBS在冰浴中磨成勻漿，600×g離心15 min后取上清為肝勻漿。肝勻漿再以10000×g離心15 min，取沉淀懸浮于PBS中，用超聲波處理，8000×g離心30 min得線粒體液。按照各測試盒操作方法測定 MDA、GSH、CAT、GPx、SOD、GST、Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及蛋白水平。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1 漏蘆提取物對模型小鼠血清ALT、AST、ALP活性和ALB含量的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清ALT、AST和ALP活性增強，ALB含量減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，漏蘆正丁醇提取物組小鼠血清ALT、AST、ALP活性減弱，ALB含量增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；漏蘆乙醇粗提物組、漏蘆水提取物組小鼠血清ALT、AST活性減弱，ALB含量增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。漏蘆提取物對模型小鼠血清ALT、AST、ALP活性和ALB含量的影響見表1。

表1 漏蘆提取物對模型小鼠血清ALT、AST、ALP活性和ALB含量的影響（±s，n＝10）Tab 1 Effects of R.uniflorum extract on the activities of ALT，AST and ALP and the content of ALB in serum of model mic（e±s，n＝10）

表1 漏蘆提取物對模型小鼠血清ALT、AST、ALP活性和ALB含量的影響（±s，n＝10）Tab 1 Effects of R.uniflorum extract on the activities of ALT，AST and ALP and the content of ALB in serum of model mic（e±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別正常對照組模型組漏蘆乙醇粗提物組漏蘆正丁醇提取物組漏蘆水提取物組聯苯雙酯組ALB，g/dl 3.27±0.422.23±0.31＊2.81±0.36#2.98±0.34#2.84±0.30#3.02±0.43#劑量，mg/kg 200200200100 ALT，U/L 20.9±2.3434.5±52.5＊294.9±28.9#212.4±31.6#253.7±35.8#136.6±17.4#AST，U/L 52.6±12.9304.3±44.2＊199.4±32.7#163.8±29.6#192.6±32.1#128.5±30.5#ALP，U/L 92.7±15.3176.5±31.8＊136.3±30.5112.6±25.4#145.1±27.9120.4±31.2#

3.2 漏蘆提取物對模型小鼠肝勻漿GSH和MDA含量的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠肝勻漿GSH含量減少，MDA含量增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，漏蘆乙醇粗提物組、漏蘆正丁醇提取物組、漏蘆水提取物組小鼠肝勻漿GSH含量增加，MDA含量減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。漏蘆提取物對模型小鼠肝勻漿GSH和MDA含量的影響見表2。

表2 漏蘆提取物對模型小鼠肝勻漿GSH和MDA含量的影響（±s，n＝10）Tab 2 Effects of R.uniflorum extract on the content of GSH and MDAin liver homogenate of model mic（e±s，n＝10）

表2 漏蘆提取物對模型小鼠肝勻漿GSH和MDA含量的影響（±s，n＝10）Tab 2 Effects of R.uniflorum extract on the content of GSH and MDAin liver homogenate of model mic（e±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別正常對照組模型組漏蘆乙醇粗提物組漏蘆正丁醇提取物組漏蘆水提取物組聯苯雙酯組MDA，nmol/mg 1.62±0.413.17±0.63＊2.56±0.57#2.08±0.39#2.52±0.37#1.92±0.34#劑量，mg/kg 200200200100 GSH，nmol/mg 34.7±3.616.8±2.5＊24.2±3.0#26.5±2.9#23.1±2.2#25.8±2.3#

3.3 漏蘆提取物對模型小鼠肝勻漿CAT、GPx、SOD、GST活性的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠肝勻漿CAT、GPx、SOD、GST活性減弱，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組比較，漏蘆乙醇粗提物組、漏蘆正丁醇提取物組小鼠肝勻漿CAT、GPx、SOD 、GST活性增強，差異具有統計學意義（P＜0.05）；漏蘆水提取物組小鼠肝勻漿GPx、GST活性增強，差異具有統計學意義（P＜0.05）。漏蘆提取物對模型小鼠肝勻漿CAT、GPx、SOD、GST活性的影響見表3。

表3 漏蘆提取物對模型小鼠肝勻漿CAT、GPx、SOD、GST活性的影響（±s，n＝10）Tab 3 Effects of R.uniflorum extract on the activities of CAT，GPx，SOD and GST in liver homogenate of model mice（±s，n＝10）

表3 漏蘆提取物對模型小鼠肝勻漿CAT、GPx、SOD、GST活性的影響（±s，n＝10）Tab 3 Effects of R.uniflorum extract on the activities of CAT，GPx，SOD and GST in liver homogenate of model mice（±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別正常對照組模型組漏蘆乙醇粗提物組漏蘆正丁醇提取物組漏蘆水提取物組聯苯雙酯組GST，U/mg 20.8±3.416.2±3.7＊22.5±3.4#24.8±3.2#21.3±3.1#22.4±3.2#劑量，mg/kg 200200200100 CAT，U/mg 14.8±2.29.7±2.0＊13.8±2.7#14.9±3.1#12.2±2.913.5±2.8#GPx，U/mg 162.7±25.8103.1±17.5＊148.5±25.6#159.3±24.8#134.5±22.7#139.2±21.3#SOD，U/mg 167.5±25.1122.1±15.3＊148.7±24.4#149.4±21.2#137.8±18.7146.8±24.2#

3.4 漏蘆提取物對模型小鼠肝線粒體ATP酶活性的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠肝線粒體Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性減弱，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，漏蘆乙醇粗提物組、漏蘆正丁醇提取物組、漏蘆水提取物組小鼠肝線粒體Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性增強，差異具有統計學意義（P＜0.05）。漏蘆提取物對模型小鼠肝線粒體ATP酶活性的影響見表4。

表4 漏蘆提取物對模型小鼠肝線粒體ATP酶活性的影響（±s，n＝10）Tab 4 Effects of R.uniflorum extract on the ATPase in liver mitochondria of model mic（e±s，n＝10）

表4 漏蘆提取物對模型小鼠肝線粒體ATP酶活性的影響（±s，n＝10）Tab 4 Effects of R.uniflorum extract on the ATPase in liver mitochondria of model mic（e±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別正常對照組模型組漏蘆乙醇粗提物組漏蘆正丁醇提取物組漏蘆水提取物組聯苯雙酯組Ca2+-Mg2+-ATPase，U/mg 8.49±0.916.23±0.76＊7.85±0.74#8.02±0.94#7.82±0.85#7.94±0.92#劑量，mg/kg 200200200100 Na+-K+-ATPase，U/mg 7.45±0.825.19±0.74＊6.33±0.62#6.78±0.94#6.31±0.75#6.54±0.63#

4 討論

APAP是最常用的解熱鎮痛藥，在治療劑量時效果顯著，且用藥安全；但在過量或特殊情況下（如飲酒、饑餓、合用某種藥物等）會對機體肝臟造成嚴重的損傷，甚至死亡[5]。當大劑量APAP進入體內，葡糖醛酸和硫酸結合反應的解毒途徑趨于飽和，過剩的APAP經肝臟P450酶系代謝生成親電子產物乙酰苯醌亞胺（NAPQI），導致肝臟GSH儲備耗竭[6]。其代謝過程中產生的大量NAPQI超過了GSH的解毒能力，于是未被清除的NAPQI與肝細胞大分子如蛋白質共價結合，引起肝細胞壞死、細胞通透性增強，使氨基轉移酶釋放入血，造成氨基轉移酶升高[7]。因此，血清ALT和AST水平的高低可靈敏反映肝細胞變性、壞死的程度[8]。本研究中，ip APAP后小鼠血清ALB含量降低，ALT、AST和ALP活性均增強，說明APAP肝損傷模型復制成功。而漏蘆不同溶劑提取物可顯著增高APAP所致急性肝損傷小鼠血清ALB含量，降低血清ALT、AST和ALP活性，提示其可減輕APAP所致小鼠肝損傷。本研究結果還顯示，聯苯雙酯的保肝活性高于漏蘆水提取物，表明漏蘆中的保肝物質主要為中等極性物質。這與正丁醇相中富含蛻皮甾酮成分的結果相吻合[4，9]。

此外，APAP在肝內代謝過程中產生的自由基會引起肝細胞膜脂質過氧化，通過破壞鈣穩態而產生細胞毒性，導致肝損傷[7]。而肝臟細胞的Ⅱ相代謝，包括解毒酶和抗氧化酶是清除體內有害物質的重要途徑[6]。同時，自由基與脂質過氧化反應還損傷線粒體膜，使伴有ATP依賴性酶的活性降低[10-11]。本研究中，APAP使小鼠肝勻漿MDA含量增加，GSH含量減少，CAT、GPx、SOD和GST活性降低，肝線粒體Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性減弱，表明急性肝損傷模型小鼠肝細胞存在一定程度的氧化應激和功能損傷。漏蘆不同溶劑提取物可降低模型小鼠肝勻漿MDA水平，增高GSH含量和多種抗氧化酶活性，增高肝線粒體ATP酶活力，提示漏蘆不同溶劑提取物可抑制脂質過氧化產物生成，減輕自由基對線粒體的氧化應激和功能損傷，這與前人的研究結果相一致[12-14]。該研究表明，漏蘆水提取物和正丁醇提取物可保護半乳糖胺或四氯化碳所致急性肝損傷，其作用與抗氧化酶活性增高有關。本研究進一步證實，漏蘆不同溶劑提取物可增強急性肝損傷模型小鼠肝組織抗氧化酶活力，減輕自由基對肝組織的氧化應激損傷，這可能是漏蘆不同溶劑提取物保肝作用的機制之一。

綜上所述，漏蘆不同溶劑提取物對APAP致急性肝損傷模型小鼠具有保護作用，其機制可能與其抗氧化作用有關。

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