PPAR-γ對人鼻咽癌CNE1/DDP細胞順鉑耐藥性的逆轉作用及其機制探討

陳 磊，鄭樹艷，黃永望

(1天津醫科大學第二醫院，天津300211;2天津市咸水沽醫院)

鼻咽癌是我國南方的常見癌癥之一，抗腫瘤藥物耐藥性的產生是其臨床治療失敗的重要原因［1］，主要與耐藥基因導致細胞藥物蓄積降低和腫瘤細胞抗凋亡能力提高有關［2～4］。多重耐藥基因 1(MDR1)及其產物P-糖蛋白(P-gp)、多藥耐藥相關蛋白(MRP)和B淋巴細胞瘤-2基因(bcl-2)的表達增高，以及磷酸化Akt蛋白(p-Akt)過度活化都可以導致耐藥性增加。氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)是一種Ⅱ型核受體，被認為是一種抑癌基因，可促進細胞凋亡、抑制腫瘤轉移［5］。羅格列酮屬于噻唑烷二酮類抗糖尿病藥物，也是細胞PPAR-γ激動劑。2013年4月～2014年2月，我們利用羅格列酮激活人鼻咽癌CNE1/DDP細胞的PPAR-γ活性，觀察PPAR-γ對細胞順鉑耐藥性的逆轉作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌細胞系CNE1購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所，人鼻咽癌順鉑耐藥細胞系CNE1/DDP為本實驗室通過大劑量沖擊法構建。羅格列酮購自浙江萬馬公司，順鉑購自Sigma公司，MTS試劑盒和RT-PCR試劑盒購自Promega公司，凋亡檢測試劑盒購自BD公司，Western抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組處理 CNE1/DDP細胞用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，含0.25%胰酶-EDTA消化。取對數生長期的CNE1/DDP細胞，接種后培養過夜。將細胞隨機分為觀察組和對照組，觀察組分別加入10、20 μg/mL羅格列酮，對照組加入等體積培養液。

1.2.2 細胞耐藥性逆轉率檢測 采用MTS法。兩組作用72 h 后，均分別加入 0、1、2、5、10、20、50、100 μmol/L順鉑，培養72 h;吸去培養基，加入MTS培養4 h后，酶標儀檢測490 nm波長下的每孔吸光度(OD值)。細胞抑制率 =(1-OD觀察組/OD對照組)×100%，根據不同濃度順鉑作用后的細胞抑制率計算IC50，細胞耐藥逆轉率 =觀察組 IC50/對照組 IC50×100%。

1.2.3 細胞凋亡和P-gp表達檢測 采用流式細胞術。兩組作用24 h后，均加入20 μmol/L順鉑，培養24 h。Anexin V/PI染色后避光孵育15 min，以流式細胞儀檢測細胞凋亡，FACSDiva軟件計算細胞凋亡率。兩組以上述方法加入順鉑并培養后，加入PE-P-gp抗體，避光孵育30 min。流式細胞儀檢測細胞P-gp表達，P-gp陽性表達為細胞膜與PE-P-gp抗體相結合，通過488 nm激發后呈紅色;FACSDiva流式軟件計算P-gp陽性率。

1.2.4 細胞 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 和 p-Akt蛋白表達檢測 采用Western blot法。兩組作用24 h，收集細胞，裂解并提取總蛋白。以12%SDSPAGE法分離并轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;分別加入PPAR-γ一抗，以β-actin作為內參;4℃孵育過夜，洗去一抗，以HRP連接的山羊抗兔IgG室溫孵育1 h，洗滌后顯示免疫反應條帶。以目的蛋白與β-actin條帶的比值表示其相對表達量。以同樣的方法檢測MDR1、MRP、bcl-2和p-Akt蛋白表達。

1.2.5 細胞 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 mRNA 表達檢測 采用RT-PCR法。兩組作用24 h后，Trizol法提取總RNA，逆轉錄得到cDNA。PPAR-γ上游引物:5'-ACTGTCGGTTTCAGAAGTGC-3'，下游引物:5'-ATGGACACCATACTTGAGC-3';MDR1上游引物:5'-TGACATTTATTCAAAGTTAAAAGC-3'，下游引物:5'-TAGACACTTTATGCAAACATTTCAA-3';MRP上游引物:5'-GGGGGAGAAAAGGTCGGCATCG-3'，下游引物:5'-GTGCAGGCCGATCTTGGCGA-3';bcl-2上游引物:5'-ACGGGGTGAACTGGGGGAGGA-3'，下游引物:5'-TGTTTGGGGCAGGCATGTTGACTT-3'。以GADPH為內參，上游引物:5'-GGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3'，下游引物:5'-CCATGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3'。反應條件:95 ℃、10 s，65 ℃、30 s，72℃、60 s，40個循環后72℃延伸5 min。目的基因相對表達以 2-ΔΔCT表示。

1.2.6 統計學方法 采用SPSS11.0統計軟件。實驗數據以±s表示，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行比較。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞耐藥逆轉率、細胞凋亡率及P-gp陽性率比較 見表1。

表1 兩組細胞耐藥逆轉率、細胞凋亡率及 P-gp陽性率比較(%，±s)

表1 兩組細胞耐藥逆轉率、細胞凋亡率及 P-gp陽性率比較(%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與觀察組10 μg/mL 比較，△P ＜0.05

組別 細胞耐藥逆轉率 細胞凋亡率 P-gp陽性率100.0 2.2 ±0.3 100.0觀察組10 μg/mL 149.3 ±11.3* 28.7 ±2.1* 62.5 ±4.2*20 μg/mL 293.8 ±25.5＊△ 43.5 ±3.7＊△ 27.5 ±1.6＊△對照組

2.2 兩組 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 和 p-Akt蛋白相對表達量比較 見表2。

2.3 兩組 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 mRNA 相對表達量比較 見表3。

3 討論

鉑類藥物雖然對鼻咽癌有一定治療效果，但易產生耐藥性而導致治療失敗。腫瘤細胞產生耐藥性的常見機制有兩種:①MDR1、MRP1等耐藥基因過表達，這些基因編碼的蛋白可跨膜轉運將藥物泵出細胞，降低細胞內藥物蓄積;②抗凋亡基因過表達導致細胞抗凋亡，細胞凋亡減少。PPAR-γ屬于PPARs家族的一員，在腫瘤組織中低表達。研究發現，誘導PPAR-γ活化可阻滯腫瘤細胞生長并誘導其凋亡，但是PPAR-γ在腫瘤耐藥中的作用研究較少。本研究中，我們將CNE1/DDP細胞經PPAR-γ激動劑羅格列酮處理24 h后，細胞中PPAR-γ mRNA和蛋白表達提高，CNE1/DDP細胞對順鉑的敏感性顯著增強。

表2 兩組 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2和 p-Akt蛋白相對表達量比較(±s)

表2 兩組 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2和 p-Akt蛋白相對表達量比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與觀察組10 μg/mL 比較，△P ＜0.05

組別 PPAR-γMDR1 MRP bcl-2 p-Akt觀察組10 μg/mL 1.72 ±0.11* 0.71 ±0.05* 0.66 ±0.03* 0.52 ±0.03* 0.63 ±0.04*20 μg/mL 2.43 ±0.18＊△ 0.27 ±0.02＊△ 0.35 ±0.02＊△ 0.24 ±0.01＊△ 0.34 ±0.02＊△對照組1.00 1.00 1.00 1.00 1.00

表3 兩組 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 mRNA相對表達量比較(±s)

表3 兩組 PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 mRNA相對表達量比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與觀察組10 μg/mL 比較，△P ＜0.05

組別 PPAR-γmRNA MDR1 mRNAMRP mRNAbcl-2 mRNA 100.0 100.0 100.0 100.0觀察組10 μg/mL 182.3 ±16.5* 64.7 ±5.3* 71.7 ±5.4* 52.8 ±4.1*20 μg/mL 232.4 ±21.7＊△ 12.2 ±0.9＊△ 38.5 ±2.1＊△ 17.6 ±1.1＊△對照組

MDR1基因及其產物P-gp嵌于細胞膜表面形成具有外排功能的能量依賴性“藥泵”，具有逆向轉運脂質等功能，將細胞內帶陽性電荷的親脂類化療藥物逆濃度泵至細胞外，防止內源性或外源性脂溶性有毒物質在胞內積聚對細胞造成毒性損害，保持細胞內環境的穩定;但其表達增高使細胞內化療藥物達不到有效作用濃度，是腫瘤耐藥的原因之一。MRP可與谷胱甘肽結合將陰離子的共軛物排泄出細胞，在清除外源性毒素中發揮作用。在人體正常組織中普遍呈低水平表達，在腫瘤組織中的表達明顯高于正常組織中，也被認為與腫瘤耐藥密切相關。本研究結果表明，羅格列酮作用后細胞MDR1、MRP mRNA和蛋白表達降低，說明PPAR-γ逆轉CNE1/DDP耐藥性的機制可能與其抑制耐藥基因MDR1、MRP的表達有關。Akt在多種腫瘤組織中都有過度表達和活化的現象，化療藥物可增加Akt磷酸化水平，在腫瘤耐藥中主要發揮促進細胞增殖和抗細胞凋亡作用，使腫瘤細胞產生化療耐受［13］。本研究發現，PPAR-γ表達增加可使細胞中p-Akt水平降低，說明抑制Akt磷酸化也是PPAR-γ逆轉鼻咽癌細胞順鉑耐藥性的機制之一。

bcl-2基因是重要的抗凋亡調控基因，其表達和調控是影響細胞凋亡的關鍵環節。bcl-2基因表達增加，抗凋亡作用增強，細胞凋亡受到抑制，從而導致耐藥。研究發現，腫瘤的多藥耐藥與bcl-2基因表達密切相關，可能與其抑制腫瘤細胞凋亡有關［6～12］。同時bcl-2 mRNA和蛋白表達降低并促進細胞凋亡，且呈劑量依賴性。本研究中，PPAR-γ表達增加使bcl-2 mRNA和蛋白表達降低，同時流式細胞術顯示，腫瘤細胞凋亡率明顯增加。

PPAR-γ對CNE1/DDP細胞的順鉑耐藥性具有逆轉作用，且呈劑量依賴性;可能與其抑制Akt磷酸化和耐藥基因MDR1、MRP表達，并促進細胞凋亡有關。

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