白介素13基因多態(tài)性與哮喘發(fā)病易感性的關(guān)系

席素雅，陳樹珍，劉建強(qiáng)，張 玲，王少穎

(1河北省胸科醫(yī)院，石家莊050000;2河北省老年病醫(yī)院)

哮喘是由多種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)參與的氣道慢性非特異性炎癥性疾病。目前認(rèn)為，哮喘是由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用所致的多基因遺傳病。近年研究發(fā)現(xiàn)，IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923C/T 多態(tài)性與哮喘發(fā)病密切相關(guān)［1～7］，但其基因多態(tài)性分布頻率因人群、種族以及生活環(huán)境的不同存在一定差異。2011年7月～2013年7月，我們對哮喘患者IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923C/T單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測，以期從遺傳學(xué)角度探討其發(fā)病機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 同期選擇河北省胸科醫(yī)院收治的哮喘患者150例(哮喘組)，均符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組2013年制定的《支氣管哮喘防治指南》標(biāo)準(zhǔn)［8］。其中男78例、女72例，年齡18～65歲。同期另擇該院體檢中心健康體檢者150例(對照組)，均無哮喘病史，無家庭及個人過敏史。其中男70例、女80例，年齡20～70歲。研究對象均為無血緣關(guān)系的北方漢族人，并除外罹患嚴(yán)重急慢性感染、腫瘤、心臟病及肝腎疾病者。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 所有研究對象取外周血3 mL，加入含1.5 mg/mL乙二胺四乙酸二鈉的抗凝管中，搖勻，常規(guī)酚—氯仿法抽提基因組DNA，-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因型檢測 采用聚合酶鏈反應(yīng)—限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA。IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923C/T引物序列參照文獻(xiàn)［9］:引物Ⅰ:5'-GGCTGAATATCCATGGTGTGTGTCC-3'，引物Ⅱ:5'-GGCTGAGGTCGGCTAGGCTGAAGAC-3'。25 μL PCR 反應(yīng)體系:10 × 緩沖液2.5 μL，4 × 脫氧三磷酸核苷(10 mmol/L)2.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，10 μmol/L 引物各 1.0 μL，模板 DNA(10 μmol/L)3.0 μL，rTaq DNA 聚合酶(5 U/L)0.25 μL，去離子加至25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)在熱循環(huán)儀上完成。循環(huán)參數(shù):95℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BsaAⅠ于37℃水浴消化8 h，然后在3%瓊脂糖凝膠上加溴化乙錠(終濃度為0.7 μg/mL)，取8 μL酶切產(chǎn)物在凝膠上上樣電泳，紫外線燈照射下觀察拍照。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件?；蛐偷腍ardy-Weinberg平衡符合程度判斷采用χ2檢驗。單個基因型及組間等位基因頻率比較采用四格表 χ2檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-13基因型分析 IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923C/T多態(tài)性位點PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為559 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，電泳結(jié)果可見3種基因型:TT型(不含酶切位點的純合子，酶切產(chǎn)物為559 bp)、CC型(含有酶切位點的純合子，酶切產(chǎn)物為310、249 bp)、CT型(雜合子，產(chǎn)物為559、310、249 bp)。隨機(jī)選取3種基因型樣本的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，其結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果完全一致。酶切結(jié)果見圖1。

2.2 兩組IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923C/T基因型和等位基因分布頻率比較 經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗，兩組基因型符合遺傳平衡，具有群體代表性(見表1)。兩組IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923C/T基因型及等位基因頻率比較見表2。哮喘組T等位基因(CT+TT基因型)攜帶者(118例，78.67%)明顯高于對照組(88 例，58.67%)(χ2=13.94，P ＜0.01)。

圖1 IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923C/T多態(tài)性PCR產(chǎn)物BsaAⅠ酶切電泳結(jié)果

表1 兩組IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923C/T基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(%)

表2 兩組IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923C/T多態(tài)性基因型和等位基因頻率分布比較［例(%)］

3 討論

哮喘是一種由多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)引起的，以氣道高反應(yīng)性為特征的變態(tài)反應(yīng)性炎癥性疾病。細(xì)胞因子作為細(xì)胞間重要信息傳遞者，在哮喘的發(fā)病過程中起著極為重要的作用。近年來，哮喘的患病率和病死率呈逐年上升趨勢，已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一［10］。

IL-13在1993年Keystone細(xì)胞因子會議上被正式命名［11］，主要是由CD+4Th2細(xì)胞分泌的多效性細(xì)胞因子，具有多種免疫調(diào)節(jié)作用。編碼人IL-13的基因位于人染色體5q31，全長約4.6 kb，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，分子量約12 kD，是由132個氨基酸組成的非糖基化蛋白。研究表明，IL-13具有促進(jìn)B細(xì)胞分化、提高B細(xì)胞活性、減少B細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)B細(xì)胞合成過多的IgE等從而增加哮喘發(fā)生的危險性。Zhu等［12］通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)，IL-13轉(zhuǎn)基因陽性小鼠可出現(xiàn)顯著的氣道炎癥、氣道阻塞及氣道高反應(yīng)性現(xiàn)象，提示IL-13可獨立參與哮喘的病理生理過程，是哮喘的一個重要的誘發(fā)因素。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，從基因水平上去認(rèn)識、診斷和治療疾病越來越受到人們的重視。多項研究表明，IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923C/T多態(tài)性與支氣管哮喘的發(fā)生密切相關(guān)。2010年華西醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病研究所的一項薈萃分析發(fā)現(xiàn)，7個基因多態(tài)性與哮喘的發(fā)病密切相關(guān)，其中IL-13+1923C/T、2044A/G基因多態(tài)性是中國成人哮喘發(fā)病的獨立危險因素［13］。侍杏華等［5～7］研究發(fā)現(xiàn)，IL-13+1923位點T等位基因可能是哮喘的易感基因。

本研究結(jié)果顯示，哮喘患者IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923位點存在C/T突變，且該基因型符合遺傳平衡，具有群體代表性。哮喘組TT型和T等位基因頻率明顯高于對照組，且T等位基因攜帶者(TT+CT型)在哮喘組明顯高于對照組。與CC純合子相比，TT+CT基因型者哮喘患病風(fēng)險明顯高于對照組，說明T等位基因與哮喘的發(fā)病相關(guān)。近年認(rèn)為，IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923 C/T突變導(dǎo)致IL-13 mRNA的表達(dá)增多進(jìn)而影響血清IL-13及總IgE的水平，進(jìn)一步導(dǎo)致哮喘的發(fā)病。其可能機(jī)制［14］為:①當(dāng)IL-13+1923位點為胞嘧啶時，甲基化DNA可直接干擾轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合，阻礙轉(zhuǎn)錄進(jìn)行，而當(dāng)發(fā)生C/T突變時，這種干擾作用消失，轉(zhuǎn)錄速度將加快，IL-13 mRNA表達(dá)量將增加。②5-甲基胞嘧啶能與特異性甲基化DNA蛋白結(jié)合，從而阻斷或取代轉(zhuǎn)錄因子的作用，轉(zhuǎn)錄速度下降;如果5-甲基胞嘧啶脫氨基形成胸腺嘧啶時，則這種阻斷作用消失，因而轉(zhuǎn)錄速度將加快。③內(nèi)含子是高等真核生物基因中主要的非編碼元件，以往曾被認(rèn)為無重要功能，但近年研究表明，它在RNA剪切過程中可能有重要作用。RNA剪切過程就是精確去除內(nèi)含子，而內(nèi)含子堿基發(fā)生位點突變后，可能造成內(nèi)含子剪切異常，并可能導(dǎo)致基因重組、外顯子重復(fù)或者外顯子再現(xiàn)而提高了特異功能結(jié)構(gòu)域的劑量，從而提高蛋白質(zhì)的活性或使翻譯后剪切產(chǎn)生多個功能單位而引起劑量效應(yīng)。當(dāng)然IL-13+1923位點基因多態(tài)性對轉(zhuǎn)錄及翻譯水平影響的確切機(jī)制尚未完全明了，這有待國內(nèi)外專家在基因分子水平上深入研究。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，觀察組IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923位點等位基因 C、T的頻率分別為63.33%、36.67%;而196例英國高加索人該位點等位基因頻率分別為82.4%、17.6%［15］。這說明不同國家、民族的人群單核苷酸多態(tài)性頻率分布因不同人群之間的遺傳距離以及各族群不同的地理環(huán)境和生活方式對基因的選擇作用不同而不同，這為人種學(xué)及人類遷徙的研究提供更多的科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，IL-13基因內(nèi)含子區(qū)+1923C/T多態(tài)性在支氣管哮喘發(fā)病過程中起重要作用，T等位基因可能是促進(jìn)哮喘發(fā)病的一個危險遺傳因素。然而，支氣管哮喘是一種多因素、多基因遺傳性疾病，單一致病基因的影響可能對疾病的發(fā)生僅產(chǎn)生微效作用。同時，由于人群的種族、地區(qū)差異以及實驗條件的局限性，IL-13 T等位基因與支氣管哮喘發(fā)病的確切關(guān)系以及能否作為哮喘發(fā)病的分子遺傳學(xué)標(biāo)志，還有待大樣本的病例對照研究、前瞻性研究以及IL-13基因在細(xì)胞內(nèi)的分子生物學(xué)水平研究進(jìn)一步加以驗證。

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