α-突觸核蛋白對大腦海馬神經元NMDA受體影響的研究

陳予東 楊巍巍 李 昕 于 順*

(1.首都醫科大學宣武醫院神經生物學研究室教育部神經變性病重點實驗室，北京100053;2.北京市老年病醫療研究中心分子診斷實驗室，北京100053)

海馬(hippocampus)，又名海馬回，是哺乳類動物腦的邊緣系統的一部分，記憶、學習、情感等高級心理活動均與海馬體有關，該部位的功能損傷和許多精神疾病相關。近年來研究［1］發現，在記憶、學習的機制研究中，神經元谷氨酸受體的活化起重要作用，尤其是N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDARs)的激活。NMDARs是電壓依賴性配體門控離子通道，具有對Ca2+高滲透性，在哺乳動物神經系統內廣泛分布，以大腦皮質和海馬密度最高，參與調節胚胎中神經系統的形成以及觸發不同形式的突觸可塑性的分子過程，包括突觸傳遞的短時程增強、長時程增強和長時程抑制［2］。NMDARs過度活躍可觸發某些機制導致神經細胞死亡，NMDARs活動異常會導致一些神經認知功能的缺失，如阿爾茨海默病、帕金森病等。

α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)由 140個氨基酸組成，在哺乳動物中樞神經系統豐富表達，與神經變性疾病的發病機制密切相關［3］。本實驗室前期的實驗［4］中發現 α-Syn可以促進 MES23.5細胞的NMDARs內在化，本實驗將重點研究α-Syn對海馬神經元NMDARs功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

健康Vista大鼠，鼠齡0～12 h，由中國軍事醫學科學院動物中心提供(實驗動物許可證號:SCXK-2014-004)。重組人 α-Syn，MK-801(Sigma公司，美國)，NMDA(Sigma公司，美國)，Neurobasal培養基(Gibco公司，美國)，B27(Gibco公司，美國)，DMEM培養基(Gibco公司，美國)，胎牛血清(FCS)(Berlin公司，美國)。

電極內液(mmol/L):CsCl 70，NaCl 10，HEPES 10，EGTA 10，Na2-ATP，Na2-GTP，CsOH 調整 pH 至7.3。細胞外液(mmol/L):NaCl 150，KCl 5，CaCl21.4，葡萄糖 10，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)5，河豚毒素(TTX)0.000 3，木防己苦毒素(picrotoxin)0.1，NBQX 0.01，士的寧(trychnine)0.002，甘氨酸 0.01，NaOH調整pH至7.3，蔗糖調整滲透壓至330 mOsm。

玻璃微電極拉制儀(Narishige公司，日本);膜片鉗放大器(Multiclamp 700B)，數據采樣板(Digidata 1322A)和數據采集分析軟件(pClamp 9.2)(Molecular Devices公司，美國);MiniAnalysis軟件包(Synaptosoft公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 重組人α-Syn的制備

將人α-Syn cDNA插入表達載體pET。然后將pET-α-Syn轉化至BL21(DE3)感受態細胞，在含氨芐西林的2%YTA培養液中培養，加IPTG誘導基因重組蛋白表達。所表達的基因重組型α-Syn采用離子交換層析和反向層析法純化。BCA法定量純化后的α-Syn。

1.2.2 海馬神經元原代培養

冰上斷頭去除Vista大鼠雙側海馬，剪碎后用0.25%胰蛋白酶37℃消化30 min，用DMEM培養基(90%DMEM+10%胎牛血清)終止消化。巴斯德玻璃滴管火焰拋光后，輕柔吹打。用DMEM培養基稀釋成5×105/mm3的密度接種到直徑35 mm多聚賴氨酸包被的培養皿，置于37℃，5%CO2的培養箱內。2 h后，顯微鏡下觀察神經元貼壁后，改用Neurobasal、B27無血清培養基繼續培養箱內培養。以后每3 d換液1次，培養10～12 d左右用于實驗。

1.2.3 實驗分組

α-Syn作用于正常培養的海馬神經元和用MK-801預處理過的海馬神經元，觀察NMDA誘發電流的變化及α-Syn對NMDA電流的影響。

1.2.4 全細胞膜片鉗記錄

采用常規高阻抗封接的全細胞記錄模式［5］，記錄細胞的電信號輸入膜片鉗放大器(Patch/Whole cell clamp amplifier，CEZ2300，Japan)，而后經由模數轉換儀 (Digidata 1320A，Axon Instrument)輸入到計算機，經10Hz濾波，采樣頻率為2～3 Hz。記錄信號的監測、存儲及通過記錄電極給予細胞的指令電壓以及分析處理由Axon軟件pClamp8.0和Clampfit 8.0完成。全細胞記錄在22℃ ～24℃室溫下進行，維持30 min以上。所有實驗均在鉗制電壓-70 mV進行。

1.2.5 給藥方法

通過軟件控制正壓給藥系統(DAD-12 Superfusion System)的通道給予NMDA(100 μmol/L)。使用HL-2型恒流泵進行細胞外灌流沖洗細胞，以除去或終止藥物的作用，換藥時間＜5 ms，給藥時間為2 s，給藥間隔為28 s。

1.3 統計學方法

應用SPSS18.0統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差(±s)表示，組間比較用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

α-Syn抑制海馬神經元NMDA誘發電流。當鉗制電壓為-70 mV時，細胞外給予100 μmol/L NMDA，在正常培養12 d左右的海馬神經元上可誘發出一較強的內向電流［INMDA=-(253.163±49.182)pA，n=12］迅速達到峰值，給予細胞外液后電流迅速恢復至靜息狀態;10 μmol/L α-Syn添加至培養12 d左右的海馬神經元，37℃孵育1 h，在鉗制電壓為-70 mV時，細胞外給予100 μmol/L NMDA，可觀察到NMDA誘發電流明顯減小［INMDA=-(164.574±45.124)pA，n=12］;NMDA受體非競爭性拮抗劑MK-801(300 nmol/L)添加至12 d左右的海馬神經元，37℃孵育30 min，在鉗制電壓為-70 mV時，細胞外給予100 μmol/L NMDA，可觀察到NMDA誘發電流被完全阻斷，如圖1。α-Syn處理的海馬神經元誘發的NMDA電流與正常海馬神經元NMDA電流相比差異有統計學意義(P＜0.05，圖2)。

3 討論

α-Syn和NMDARs的異常均與帕金森病、阿爾茨海默病等神經變性病的發病機制密切相關［6］。文獻報道［7］帕金森病發病機制包括興奮性氨基酸釋放過多或滅活機制受損可引起神經興奮性毒性作用。當黑質的多巴胺能神經元損傷后，谷氨酸能神經元異常活躍，激活NMDARs引起神經元內Ca2+超載，觸發相關級聯反應，最終致神經元變性壞死。

圖1 α-Syn抑制海馬神經元INMDA峰值Fig.1 Inhibition of α-Syn on INMDAin cultured hippocampal neurons

圖2 α-Syn對海馬神經元NMDA誘發電流的作用Fig.2 Effect of α-Syn on INMDAin cultured hippocampal neurons

NMDA誘發電流的大小反映了神經元膜上NMDARs的數量和功能狀態［8］，NMDA誘發電流減小表明α-Syn引起了神經元膜上NMDARs活性降低、失活或NMDARs數量減少。筆者在實驗中觀察到經α-Syn抑制了NMDA誘發電流，進一步證實了α-Syn可引起神經元膜的NMDARs數量減少和功能異常。筆者認為α-Syn可能通過促進神經元胞膜NMDARs內在化抑制NMDA的神經元興奮性毒性，而帕金森患者腦中存在大量異常聚集、修飾的α-Syn，損害α-Syn調節NMDARs的內在化，從而引起學習、記憶障礙，并且這種改變也可能存在于阿爾茨海默病患者腦中。

綜上所述，本研究發現α-Syn引起神經元膜的NMDARs數量減少、功能異常，從而抑制了NMDA的神經毒性。但因α-Syn相對分子質量小，可自由進出胞膜［9］，因此其對NMDARs的作用是直接作用于膜上的NMDARs還是進入胞內后通過其他環節再作用于受體，尚需進一步探索。

［1］ Paoletti P，Bellone C，Zhou Q.NMDA receptor subunit diversity:impact on receptor properties，synaptic plasticity and disease［J］.Nat Rev Neurosci，2013，14(6):383-400.

［2］ Baskys A，Bayazitov I，Fang L，et al.Group I metabotropic glutamate receptors reduce excitotoxic injury and may facilitate neurogenesis［J］.Neuropharmacology，2005，49 Suppl 1:146-156.

［3］ Yu S，Uéda K，Chan P.Alpha-synuclein and dopamine metabolism［J］.Mol Neurobiol，2005，31(1-3):243-254.Review.

［4］ Cheng F，Li X，Li Y，et al.Alpha-Synuclein promotes clathrin-mediated NMDA receptor endocytosis and attenuates NMDA-induced dopaminergic cell death［J］.Neurochem，2011，119(4):815-825.

［5］ Wu H Y，Yuen E Y，Lu Y F，et al.Regulation of N-methyl-D-aspartate receptors by calpain in cortical neurons［J］.J Biol Chem，2005，280(22):21588-21593.

［6］ 李昕，楊巍巍，李雁，等.一種檢測帕金森患者血漿促進α-突觸核蛋白寡聚體形成能力的方法［J］.首都醫科大學學報，2013，34(6):830-834.

［7］ Dingledine R，Borges K，Bowie D，et al.The glutamate receptor ion channels［J］.Pharmacol Rev，1999，51(1):7-61.Reviews.

［8］ Kiss J P，Szasz B K，Fodor L，et al.GluN2B-containing NMDA receptors as possible targets for the neuroprotective and antidepressant effects of fluoxetine［J］.Neurochem Int，2012，60(2):170-176.

［9］ Cheng F，Vivacqua G，Yu S.The role of α-synuclein in neurotransmission and synaptic plasticity［J］.J Chem Neuroanat，2011，42(4):242-248.