人破骨細胞的體外分離培養及與骨髓瘤細胞的相互作用

張建華 董春霞 任方剛 覃艷紅 楊林花

(山西醫科大學第二醫院血液科，太原030001)

骨髓瘤(multiple myeloma，MM)細胞促進骨髓微環境中破骨細胞前體(osteoclast precursor cell，pOC)向破骨細胞(osteoclasts，OC)分化，介導溶骨性骨重吸收，骨質溶解及骨重吸收導致細胞外基質釋放多種細胞因子促進MM細胞生長，從而在骨質破壞及腫瘤進展中形成惡性循環。研究［1-3］表明，阻斷溶骨途徑可以發揮抗骨髓瘤效應。本實驗旨在探討正常人破骨細胞體外分離培養的可行性及與MM細胞之間的相互作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株

8226細胞引自美國組織細胞庫。

1.2 試劑和儀器

RPMI-1640、α-MEM培養基為美國Gibco公司產品;新生牛血清購自杭州四季青生物材料研究所;核因子κB受體激活劑-Fc段(receptor activator of nuclear factor kappa-B Fc，RANKL)、巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colone-stimulating factor，M-CSF)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)為美國Cytolab公司產品，碘化丙啶、二甲亞砜、耐酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)試劑盒均為美國Sigma公司產品;淋巴細胞分離液(Ficoll)為上海化學試劑三廠產品;Annexin-V凋亡試劑盒購自澳大利亞Bender MedSystems公司;地塞米松為上海通用制藥公司產品;Transwell培養板購自美國Costar公司;培養箱購自德國Heraeus公司;倒置顯微鏡日本Olympus公司;低溫冰箱購自美國Legaci公司。

1.3 定型的破骨細胞前體及破骨細胞的準備

白細胞為紅十字中心血站提供，采自健康成年男性。將20 mL白細胞用無鈣鎂PBS緩沖液3倍稀釋后，沿管壁緩緩加入盛有Ficoll液的離心管中，使其懸于分離液上方，室溫下2 000 r/min離心30 min后收集混濁帶分離獲得的細胞，用無鈣鎂PBS洗3次，后用含10%小牛血清、50 ng/mL RANKL、25 ng/mL M-CSF 及10 nmol/L 地塞米松的α-MEM培養基(OC培養基)調整細胞至2.5×106/mL，接種于25 mL培養瓶，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱，培養2～4 d后用新鮮培養基洗3次去除懸浮細胞，貼壁細胞為單個核，TRAP+細胞，認為是定型的破骨細胞前體細胞。繼續加入OC培養基培養6～10 d后即可形成大量多個核的破骨細胞。

1.4 pOC的遷移實驗

趨化實驗采用24孔Transwell培養板，孔徑為5 μm。按millipore transwell操作說明進行，上室為每300 μL pOC(1×105)懸液(OC條件培養基培養后)，下室為700 μL條件培養基(1×106/mL 8266細胞培養后)或新鮮培養基，培養3 h后去transwell insert，TRAP染色，計算2組細胞的遷移率。

1.5 pOC的分化實驗

新鮮分離的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)或定型的 pOC(1×106/mL)與5×105/mL的8226細胞在含10%小牛血清、25 ng/mL M-CSF的α-MEM培養基(無RANKL)共培養7～14 d后行TRAP染色，實驗分為2組:A組為PBMCs+8226細胞;B組為pOC+8226細胞。

1.6 PBMC-OC與MM細胞的共培養實驗

收集上述培養的PBMC-OC，按每孔2.4×104個接種于24孔板，加入M-CSF及RANKL繼續培養24 h貼壁。細胞增生實驗組加入每孔1×105個8226細胞，單獨或共培養3 d、7 d后分別觀察計數。細胞周期實驗組每孔加入2×105個8226細胞，同時設非直接接觸組(Transwell組)，單獨或共培養48 h后收集細胞，PBS洗2次，采用PI染色流式細胞術檢測。細胞凋亡實驗組加入每孔2×105個8226細胞，分為2組:去血清培養組用1%α-MEM培養基;地塞米松(Dex)組加入2×10-7μmol/mL Dex，單獨或共培養48 h后收集細胞，PBS洗2次，Annexin-V/PI標記，流式細胞術檢測。

1.7 OC對MM細胞的吞噬實驗

8226細胞經10-6mol/L Dex培養5 d后誘導細胞死亡，臺盼藍(用PBS按1:1稀釋)染色10 min后PBS洗3次，重懸于OC培養基，加至每孔含1×105個OC的24孔培養板，培養4～24 h后顯微鏡觀察。

1.8 統計學方法

用SPSS10.0進行統計學分析，計量數據以均數±標準差(±s)表示，組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PBMC-OC的生長特性

pOC及成熟的多個核的OC來源于健康成人的PBMCs，pOC經OC培養基培養4 d后棄去懸浮細胞，貼壁細胞大部分為髓系單個核細胞，其中95%表達TRAP，pOC經OC培養基繼續培養6～10 d后，可見單個核細胞逐漸成梭形，融合形成多個核的TRAP+細胞。

2.2 MM細胞條件培養基誘導pOC遷移

采用24孔Transwell培養板行pOC趨化實驗顯示，8226細胞(1×106/mL)培養后的條件培養基可誘導pOC明顯遷移，而新鮮培養基組僅見很少部分細胞遷移，兩組細胞的遷移率分別為(28.36±0.08)%、(1.53±0.06)%，(P ＜0.01，圖1)。

圖1 骨髓瘤細胞條件培養誘導pOC遷移Fig.1 Multiple myeloma cell conditioned medium induced pOC migration.

2.3 MM細胞誘導pOC向OC分化

在無RANKL的培養環境中，定型的pOC與8226細胞共培養7～14 d后可見多個核的TRAP+細胞形成，而PBMCs與8226細胞共培養組細胞逐漸崩解死亡，未見OC生成(圖2A、2B)。

圖2 骨髓瘤細胞條件培養基誘導pOC遷移Fig.2 Multiple myeloma cells actively attracted pOCs and induced OCs formation(200×)

2.4 PBMC-OC促進MM細胞增生

8266細胞與PBMC-OC單獨或共培養3 d、7 d后計數顯示，與OC共培養后增生更明顯，細胞數分別為:對照組 (2.1±0.11)×105和(3.9±0.09)×105，共培養組(4.0±0.15)×105和(9.0±0.14)×105(P＜0.01，圖3)。流式細胞術檢測細胞周期顯示，8226與PBMC-OC直接接觸或非直接接觸培養后，G0/G1期細胞比例減少，而S期細胞比例增多。

圖3 PBMC-OC促進骨髓瘤細胞增生Fig.3 PBMC-OC stimulate the proliferation of multiple myeloma cells

2.5 MM細胞促進OC存活

在無M-CSF及RANKL條件下，OC與MM細胞共培養7 d后，幾乎所有OC仍可存活;相反，OC單獨培養組細胞數量逐漸減少、破碎細胞增多。

2.6 PBMC-OC可抑制去血清培養誘導的MM細胞的死亡

8226細胞用1%α-MEM培養基培養48 h后Annexin-V-及PI-細胞(存活細胞)減少至(26.24±0.11)%，與OC共培養后 Annexin-V-及PI-細胞為(90.92±0.15)%(P ＜0.01，圖4)。

圖4 PBMC-OC抑制去血清培養誘導的骨髓瘤細胞的死亡Fig.4 PBMC-OCs rescued multiple myeloma cells from death in serum-depleted cultures

2.7 PBMC-OC對地塞米松誘導的MM細胞的死亡無拮抗作用

8226細胞經2×10-7μmol/mL Dex培養48 h后41.36%細胞死亡，與OC共培養后死亡細胞數無明顯減少，為30.71%(P＞0.05)。

2.8 OC吞噬死亡的MM細胞

OC可通過吞噬作用清除死亡的8226細胞，從而促進細胞生長與存活(圖5)。

圖5 OC吞噬死亡的8226細胞Fig.5 Osteoclasts phagocytic 8226 cell death(200 × )OC:osteoclasts.

3 討論

MM骨病以MM細胞浸潤部位成骨細胞減少為特征，提示腫瘤細胞可能通過產生關鍵的OC生成因子直接增強OC活性。臨床實驗及MM動物模型研究顯示［1-3］，OC 抑制劑，包括雙磷酸鹽、RANK-Fc及骨保護蛋白(osteoprotegerin，OPG)，不僅阻斷MM介導的骨質破壞，而且發揮抗骨髓瘤效應阻止腫瘤進展。這些發現提示OC與MM細胞之間的相互作用可能對骨髓瘤細胞在骨髓中擴增發揮重要作用。然而由于OC體外分離培養的困難，這一作用以及相關機制的研究涉及甚少。

本實驗參照 Sabokbar等［4］及 Yaccoby 等［5］的體外OC培養方法，利用采自健康成年男性的白細胞分離出單個核細胞，在完全OC培養基中培養4 d后可見大部分髓系單個核細胞為TRAP+細胞，即定型的pOC。pOC與8226細胞共培養后發現，在無基質細胞的培養條件下，MM細胞可招募定型的pOC，直接促進其向成熟的OC分化，而MM細胞并不促進未定型的祖細胞向OC分化，提示定型的pOC可能上調MM細胞對RANKL的表達，在骨髓微環境中其他細胞或細胞因子把髓系單個核祖細胞定型為破骨細胞系。這與Yaccoby等［5］利用原代 MM漿細胞與采自 MM患者外周血分離培養的OC共培養結果一致，他們推測MM患者骨中除成骨細胞減少外，血管內皮細胞增多可能也參與上述過程。血管內皮細胞可以產生趨化因子對單個核細胞具有趨化作用，表達OC生成的關鍵因子如M-CSF、RANKL及OPG，還可以直接誘導活化的多個核OC生成。Okada等［6］研究證實，B9/BM1鼠MM細胞通過CD44上調骨髓內皮細胞表達RANKL，進而通過直接接觸作用促進pOC向OC分化并遷移至骨髓。

在上述培養體系中，pOC經完全OC培養基繼續培養6～10 d后，可見單個核細胞逐漸成梭形、融合形成多個核的TRAP+細胞，即為破骨細胞。隨后本課題組將OC與MM細胞(8226細胞)共培養后行顯微鏡觀察計數、PI染色檢測細胞增生周期及Annexin-V/PI標記檢測存活細胞比例顯示，在無 M-CSF及RANKL條件下，MM細胞仍可促進OC存活;OC明顯非IL-6細胞系增生，抑制去血清培養誘導的MM細胞死亡，直接或間接共培養組OC均可促進MM細胞進入S期，提示MM細胞與OC之間的相互作用是雙向的。這與Abe等［7］研究結果一致，健康人群及MM患者自身PBMC-OC均可促進MM細胞存活，且作用強于骨髓基質細胞。他們的研究結果還顯示，OC可以拮抗阿霉素誘導的MM細胞的死亡，OC與MM細胞共培養后IL-6及骨橋蛋白(osteopontin，OPN)分泌增多，阻斷細胞之間的相互作用后IL-6質量濃度明顯下降，但MM細胞增生與IL-6質量濃度增加并無明顯相關。本課題組研究結果顯示，OC對地塞米松誘導的MM細胞死亡并無拮抗作用。結合Abe等［7］研究結果提示MM骨病患者可能對阿霉素產生耐藥，而地塞米松對MM骨病患者的MM細胞仍具有殺傷作用。本課題組將8226細胞誘導死亡與OC共培養24 h后通過顯微鏡觀察發現，OC可以吞噬死亡的MM細胞，Yaccoby等［5］研究結果也顯示OC可通過吞噬作用清除凋亡及死亡的MM細胞，而不影響MM細胞的活力及生長存活的能力。上述結果提示OC可能通過直接接觸作用或與某些細胞因子的分泌共同作用，以及對MM細胞的吞噬作用促進MM細胞增生與存活。

Zavrski等［8］體外實驗發現，蛋白酶體抑制劑(MG-132、MG-262)通過抑制破骨細胞中蛋白酶體-泛素系統阻斷RANKL介導的OC生成及其生物學活性。在以硼替佐米為主方案治療合并骨病的MM患者臨床研究中也顯示［9-11］，除優越的疾病緩解率外，骨痛緩解率及骨質修復亦明顯高于其他方案，其中不乏更多的節點因子參與。本課題組已經完成的破骨細胞在多發性骨髓瘤發病中的作用這一研究結果也顯示［12］，RANKL/OPG在二者相互作用中發揮重要作用。為體外培養破骨細胞的可行性及簡便性進一步研究其與骨髓瘤細胞相互作用中的節點因子提供了可靠的平臺，RANKL/OPG在這一相互作用中的重要性及其對MM分期及骨病早期評價中的地位有待進一步研究證實［13］。

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