醚菊酯對日本囊對蝦肝胰腺細胞DNA損傷效應的研究

劉 波, 陳宇鋒, 鄭惠東, 許貽斌, 鄭盛華, 鐘碩良

(福建省水產研究所, 福建 廈門 361013)

彗星實驗又稱單細胞凝膠電泳(Single Cell Eletrophoresis, SCGE), 最早由Ostling等[1]于1984年提出, 根據電泳后DNA的拖尾長度定量檢測真核細胞中的 DNA損傷程度。后經其他學者不斷改進, 使SCGE敏感性大大提高, 不僅可以檢測到DNA雙鏈和單鏈斷裂, 還能檢測到DNA的堿性不穩定結構[2-4]。目前, SCGE主要應用于哺乳動物淋巴細胞DNA損傷等研究領域[5-7], 在水生生物細胞損傷的研究方面報道較少, 現有研究可見 SCGE檢測真鯛(Pagrosomus major)血細胞 DNA損傷及扇貝血淋巴細胞DNA損傷等報道[8-9]。醚菊酯作為常用的醚類農藥,兼具了擬除蟲菊酯類農藥的優點, 是20世紀70年代迅速發展起來的新型農藥, 具有高效、低毒、低殘留等環境安全性的優點[10]。近年來, 由于菊酯類農藥的廣泛應用和人類活動的不斷增加, 其代謝產物在食品和水環境中的影響日益嚴重。醚菊酯在環境和生物樣品中的殘留及分布表現為明顯的接觸性特點,這與擬除蟲菊酯類農藥的殘留特點相似, 其對養殖生物遺傳物質的基因毒性進一步引起人們的擔憂。但是, 有關醚菊酯等菊酯類農藥的相關研究主要集中在神經毒性和環境內分泌干擾方面[11-12], 國內外關于醚菊酯基因毒性的研究報道較少。

日本囊對蝦是中國沿海地區水產養殖重要經濟種類之一, 在海水養殖生物中具有良好的代表性,醚菊酯是否對日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicas)肝胰腺細胞具有遺傳毒性作用而引起DNA損傷, 國內外尚未見報道。作者通過彗星實驗技術研究醚菊酯對日本囊對蝦肝胰腺細胞DNA的損傷特征, 探討了醚菊酯對日本囊對蝦的遺傳毒性機制, 為中國沿海水產養殖環境的污染監測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

醚菊酯為廣州植物龍生物技術有限公司產品;低熔點瓊脂糖凝膠、綠色熒光DNA染料、EDTA溶液(0.5 mol/L)、10×細胞裂解液(0.1 mol/L Tris, 10%肌氨酸鈉, 10% Triton X-100)為美國CELL BIOLABS公司產品; NaCl、NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4等常規藥品均為國產分析純試劑, 上海生物工程有限公司產品。

實驗用玻片為美國Cell Biolabs公司產品, 超凈工作臺為蘇州智凈化設備有限公司的 SW-CJ-1D型,電熱恒溫水浴鍋為上海精宏公司的DK-S26型, 電泳儀為美國 Thermo公司的EC250-90型, 水平電泳槽為北京君意公司的 JY-SP-E型, 熒光顯微鏡為德國Leica公司的DM5500 B型。

1.2 實驗動物

實驗用日本囊對蝦購自福建省水產研究所大徑中試基地附近的農貿市場, 平均體長(11.36±0.93)cm,平均體質量(10.72±2.70)g。在水泥池中暫養一周, 每天定時定量投喂對蝦配合飼料, 挑選健康無病、附肢齊全無外傷且規格統一的對蝦作為實驗用蝦。

1.3 處理方法

急性毒性實驗表明, 日本囊對蝦的死亡率與醚菊酯的濃度顯著性正相關(P<0.01), 具有明顯的濃度-效應和時間-效應關系, 醚菊酯對日本囊對蝦24、48和 96 h 半致死濃度(LC50)分別為 1.88×10–3、1.30×10–3和 0.76×10–3mg/L。根據 LC50值和特倫堡(Tumbel)安全濃度計算公式(SC=48 h LC50×0.3/(24h LC50÷48h LC50)2), 綜合考慮近海海水中醚菊酯低濃度水平因素, 設定亞急性毒性實驗的處理濃度, 將日本囊對蝦分為6組進行不同劑量的處理, 設置1個空白對照組, 5 個實驗處理組(1.5×10–5, 0.3×10–4, 0.9×10–4,1.8×10–4, 3.6×10–4mg/L), 每組 30 尾日本囊對蝦。在1 m2的水泥池內用沙濾海水微充氣正常培育, 實驗過程中海水溶解氧(5.62±0.18)mg/L、pH(8.06±0.08)、水溫(18.36±0.26)℃、鹽度(30.00±0.02)。每日更換實驗用水, 重新設置醚菊酯的相應處理濃度, 保證實驗期間處理濃度一致。各實驗處理組在持續處理25 d后隨機采集3尾日本囊對蝦, 放入冰盒備用。

1.4 細胞懸液制備

剪取各實驗處理組日本囊對蝦肝胰腺組織0.2～0.5 g至1.5 mL滅菌離心管內, 各實驗處理組設置為3組平行, 加入4℃預冷的0.01 mol/L PBS緩沖液(含0.02 mol/L EDTA)1 mL, 冰浴搗碎組織懸浮細胞, 懸浮液靜置5 min后轉入新的離心管, 3000 r/min離心2 min后棄上清, 用4℃預冷的0.01 mol/L PBS緩沖液重懸細胞, 調節細胞濃度為 1×105個/mL, 鏡檢觀察細胞活性后待用。

1.5 彗星實驗方法

按照Cell Biolabs公司的彗星分析試劑盒實驗步驟進行單細胞凝膠電泳分析[13]。

1.5.1 制片

將彗星分析試劑盒的低熔點瓊脂糖凝膠在90～95℃水浴鍋內加熱溶解20 min, 再轉入37℃水浴鍋冷卻20 min備用。細胞懸液與低熔點瓊脂糖凝膠按1∶10的比例混合, 迅速吸取75μL混合液均勻涂抹于彗星分析玻片上, 將玻片置于4℃冰箱避光固化15 min。

1.5.2 裂解和解旋

將玻片放入預冷的細胞裂解液(2.5 mol/L NaCl,0.1 mol/L EDTA, 0.01 mol/L Tris, 1%肌氨酸鈉, 1%Triton X-100, pH10.0)中, 置于4℃冰箱避光裂解30～60 min。裂解完畢后用蒸餾水小心的沖洗玻片, 將清洗后的玻片放入預冷的堿性液(0.3 mol/L NaOH, 1 m mol/L EDTA, pH>13)中, 置于4℃冰箱避光解旋30 min。

1.5.3 電泳和染色

將玻片小心地移入水平電泳槽, 倒入預冷的堿性電泳緩沖液(0.3 mol/L NaOH, 1 mmol/L EDTA,pH>13), 在電壓1 V/cm, 電流300 mA的條件下電泳15～30 min。電泳結束后輕輕移出玻片, 用預冷的蒸餾水浸泡2 min, 重復兩次洗去多余堿, 再用70%酒精浸泡固化5 min。將玻片取出完全空干, 每個處理滴加100 μL的綠色熒光DNA染料, 室溫避光染色15 min。

1.6 圖像分析和數據處理

通過熒光顯微鏡觀察玻片, 并進行顯微攝影,每個處理采集60個細胞進行拍照和數據分析, 各實驗處理組3個平行共統計180個細胞。圖像用彗星分析軟件Comet Score 1.5進行分析, 采用拖尾率、彗星尾長、彗尾DNA相對含量、尾距和Olive距等參數評價日本囊對蝦DNA的損傷程度。其中拖尾率=拖尾細胞數/觀察細胞數×100%、彗尾DNA相對含量=尾部 DNA含量/細胞總 DNA含量×100%、尾距=尾長×彗尾 DNA相對含量×100%、Olive距=頭尾部中心間距×彗尾DNA相對含量×100%。應用Excel軟件及SPSS16.0軟件對所獲得的數據進行單因素方差分析, 檢驗顯著性并計算出回歸方程。

2 結果

2.1 醚菊酯處理對日本囊對蝦肝胰腺細胞DNA的影響

醚菊酯對日本囊對蝦 24h和 48h半致死濃度(LC50)分別為 1.88×10–3mg/L 和 1.30×10–3mg/L, 根據 LC50值和特倫堡(Tumbel)安全濃度計算公式(SC=48 h LC50×0.3/(24h LC50÷48h LC50)2)計算得出其安全濃度為0.19×10–3mg/L。在此基礎上對各實驗組進行處理, 各實驗組經熒光染料染色后在熒光顯微鏡下觀察, 隨機采集180個細胞進行統計分析, 空白對照組的肝胰腺細胞DNA結構緊密, 染色后呈圓形熒光團, 無拖尾現象; 各實驗處理組損傷細胞DNA的斷裂碎片在電場中離開核DNA向陽極遷移,染色后形成彗星狀拖尾。隨著處理濃度的增加, 細胞核DNA損傷越嚴重, 斷裂的碎片或堿變性片段就越多, 彗星尾長相應增加, 尾部熒光強度也相應增強。圖 1為醚菊酯不同處理濃度對日本囊對蝦肝胰腺細胞DNA損傷的單細胞凝膠電泳彗星圖像。表1是醚菊酯不同處理濃度對日本囊對蝦肝胰腺細胞DNA損傷的彗星實驗統計分析結果, 該實驗結果表明, 不同實驗處理組的拖尾率、彗星尾長、彗尾DNA相對含量、尾距和Olive距與空白對照組之間的差異具有統計學意義(P<0.01), 差異極顯著。實驗數據顯示對照組受損細胞極少, 拖尾率僅為5.06%±0.87%, 彗尾DNA相對含量、尾距和Olive距都接近0, 細胞沒有發生 DNA 斷裂形成彗星圖像; 1.5×10–5～3.6×10–4mg/L醚菊酯處理25 d后各指標值相應增加, 且當處理劑量為 3.6×10–4mg/L時, 各指標值迅速顯著增加, 說明日本囊對蝦肝胰腺細胞對醚菊酯毒性存在較為敏感的閾值范圍。

圖1 醚菊酯不同處理濃度對日本囊對蝦肝胰腺細胞DNA損傷的彗星圖像Fig.1 The comet assay images of DNA damage in hepatopancreas cells of Marsupenaeus japonicas exposed to different concentrations of ethofenprox

表1 醚菊酯不同處理濃度對日本囊對蝦肝胰腺細胞DNA損傷的彗星實驗指標數據Tab.1 The parameters of DNA damage in hepatopancreas cells of Marsupenaeus japonicas exposed to different concentrations of ethofenprox using comet assay method

2.2 日本囊對蝦肝胰腺細胞 DNA損傷各項實驗指標與醚菊酯處理濃度的回歸分析

表1的實驗結果表明, 各實驗指標數據隨著處理濃度的變化顯著增加, 呈現一定的劑量效應關系,各實驗指標與處理濃度之間存在較好的相關性。經彗星分析軟件Comet Score 1.5 得到的各項實驗指標與醚菊酯處理濃度進行線性、多項式和指數擬合回歸分析后, 其多項式回歸分析擬合度(R2>0.99)最高,各項實驗指標的回歸方程如表 2所示。醚菊酯處理濃度與彗星尾長、Olive距、彗尾DNA相對含量和拖尾率等參數的多元回歸方程為Y=–0.256 + 0.122X1+0.11X2– 0.0255X3– 0.044X4(P<0.005), 其中Y表示醚菊酯處理濃度,X1表示彗星尾長,X2表示Olive距,X3表示彗尾DNA相對含量,X4表示拖尾率, 回歸方程相關極顯著。

表2 醚菊酯不同處理濃度對日本囊對蝦肝胰腺細胞DNA損傷各實驗指標的回歸方程Tab.2 The regression equation of parameters of DNA damage in hepatopancreas cells of Marsupenaeus japonicas exposed to different concentrations of ethofenprox

3 討論與結論

醚菊酯作為一種廣泛使用的菊酯類農藥, 通過作用神經軸突, 抑制相應神經功能發揮滅殺作用[14],菊酯類農藥在遺傳物質基因毒性的作用機制方面研究還不多, 有研究報道表明, 菊酯類農藥在各種動物實驗中可導致血細胞、骨髓細胞、肝腸等組織細胞遺傳毒性作用, 產生DNA雙鏈、單鏈斷裂和姐妹染色單體交換等現象[15-17]。作者選用拖尾率、彗星尾長、彗尾DNA相對含量、尾距和Olive距等國內外各彗星圖像分析軟件使用的標準指標, 應用Comet Score 1.5彗星圖像分析軟件對各指標進行精確的測定分析。實驗結果表明, 實驗選擇的處理時間和濃度在彗星實驗檢測閾值范圍內[18], 隨著處理濃度的增加, 肝胰腺細胞 DNA超螺旋結構越松散, 斷裂點越多, DNA碎片越小, 向陽極遷移的彗星尾部DNA片段越多, 檢測指標都呈漸進的規律性趨勢,表現出良好的劑量效應關系, 說明上述檢測指標在本實驗條件下能較客觀地反映DNA損傷程度, 具有良好的代表性。這與Hellman等[19]的報道一致: 在一定的閾值范圍內, 彗星尾長、彗尾DNA相對含量、尾距和Olive距等指標的分析結果比較可信。各檢測指標數據表明, 醚菊酯對日本囊對蝦肝胰腺細胞DNA作用較為敏感, 處理濃度在較低水平1.5×10–5mg/L時, 實驗處理組與空白對照組相比各檢測指標就表現出顯著性差異(P<0.01), 而當處理濃度達到 3.6×10–4mg/L, 超過安全濃度 1.9×10–4mg/L(根據特倫堡Tumbel安全濃度公式計算得出)時, DNA損傷顯著加劇, 該實驗處理組與其他各實驗處理組相比各檢測指標都表現出顯著性差異(P<0.01), 說明日本囊對蝦肝胰腺細胞對醚菊酯毒性存在高速反應的閾值范圍。

由于人類農業生產活動的廣泛開展, 其長期持續用藥導致近海海域生態環境低濃度長時間污染,造成養殖生物魚、蝦、貝的長期暴露, 因此, 為了全面評價醚菊酯在近海海域生態環境中的影響因子,作者對實驗各檢測指標進行回歸分析和相關分析,數據分析表明各檢測指標與處理濃度之間存在高度的相關性, 且各指標的相關系數均有統計學意義,表現出顯著性差異(P<0.05), 幾何參數彗星尾長是較為直接的可靠指標, 而尾距和Olive距則更能全面地反映處理濃度對肝胰腺組織細胞DNA的損傷程度。在處理濃度與彗星尾長、尾距、Olive距、彗尾DNA相對含量和拖尾率等參數的多元回歸分析過程中發現, 處理濃度對尾距和Olive距的影響作用類似, 但Olive距的回歸方程顯著性更高(P<0.005), 尾距表現為排除的變量。多元回歸方程表明, 對于日本囊對蝦肝胰腺組織而言, 最好的檢測參數是彗星尾長和Olive距, 即產生影響最顯著的因素。本實驗在對各指標分別建立一元回歸方程的基礎上, 又通過 SPSS軟件進行聚類和判定分析, 篩選影響因子更大的檢測指標, 建立了多參數的多元回歸方程進行全面的DNA損傷變化規律研究, 并擬通過多元回歸方程有效地推斷醚菊酯處理濃度和處理時間, 為評估菊酯類農藥等污染物對近海海域生態環境的影響奠定基礎。

DNA損傷可以導致各種類型的突變, 包括潛在長期的致癌效應和致畸效應等[20], 作者以日本囊對蝦肝胰腺細胞為研究對象, 采用標準的彗星實驗分析方法對醚菊酯的遺傳毒性進行檢測, 證明醚菊酯對沿海地區水產養殖生物的致突變、致癌、致畸等危害作用應該引起人們的足夠重視, 這種潛在長期的危害會嚴重影響近海海域水生生物種質資源, 造成種質衰退、種群數量減少等問題。我們認為, 菊酯類農藥造成DNA損傷的主要途徑是通過自由基活化,與DNA的無嘌呤位點結合形成堿性不穩定位點, 最終DNA鏈在堿性條件下發生斷裂, 這與其他文獻的觀點一致[21]。研究發現, 單細胞凝膠電泳彗星實驗可以在細胞分子水平直接反映出生態環境污染對水生生物的影響, 通過對 DNA損傷的評估, 這一技術手段有望成為監測近海菊酯類農藥等污染物對水生生物基因毒性的新方法, 在該研究領域具有廣闊的應用前景。

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