雜色龍蝦線粒體基因組全序列的測定與分析

劉 皓, 姚 維, 劉海情, 劉楚吾, 劉 麗

(廣東海洋大學 水產學院 南海水產經濟動物增養殖廣東普通高校重點實驗室, 廣東 湛江 524025)

動物線粒體基因組(mitochondrial DNA, mtDNA)是核外遺傳物質, 結構簡單, 具有典型的母系遺傳特征[1], 受精時, 父本 mtDNA 無法進入卵細胞, 受精卵的 mtDNA直接來自母本, 不存在父母雙方mtDNA的重組過程。mtDNA進化速度相對較快, 大約是單拷貝核基因進化速度的6～7倍[2-3]。mtDNA還缺少具有校對功能的酶, 呈游離裸露狀態且無組蛋白的保護, 由于其修復系統不健全、代增時間比較短和選擇壓力小等原因, 造成的突變很容易固定下來。盡管動物線粒體在基因組成上具有很高的保守性,但在種群內或不同物種間存在較大的差異[2,4-6]。利用這種高效的單倍體母系遺傳方式以及差異性,只需少量材料就能反映群體的遺傳結構, 可縮減用于測有效種群的群體大小, 提高對遺傳漂變的敏感性, 便于進行群體分析[7]。后生動物 mtDNA為典型的環狀雙鏈分子結構, 長度大多在14～18 kb,編碼 37個基因, 包括 13個蛋白質基因、22個tRNA基因以及12s rRNA和16s rRNA基因[8]。近年來, 研究者們非常關注后生動物 mtDNA的基因排列, 主要是因為它是研究系統進化的一個很好的模型[9-12]。

作者報道了雜色龍蝦的線粒體基因組全序列特征, 并在雜色龍蝦(Panulirus versicolor)、中國龍蝦(Panulirus stimposni)、波紋龍蝦(Panulirus homarus)3個物種線粒體基因組全序列的基礎上分析了龍蝦屬線粒體基因組多態位點及遺傳變異, 為進一步從分子水平對龍蝦類的分類研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用雜色龍蝦樣品來自廣東湛江霞山水產品市場, 取其肌肉, –20℃保存于無水乙醇中備用。

1.2 基因組總DNA的提取

以雜色龍蝦的肌肉為實驗材料, 參照《現代分子生物學實驗技術》, 采用苯酚-氯仿法提取基因組總DNA[13]。并利用核酸定量儀檢測DNA的濃度和純度,然后4℃保存備用。

1.3 引物設計

利用甲殼動物cox1,nad5和Cytb 3種編碼基因的通用引物擴增出 3個片段[14-16]。然后在 GenBank中選取與雜色龍蝦線粒體基因組同源性比較高的 3個物種(中國龍蝦(NC014339)、日本龍蝦(Panulirus japonicus)(NC004251)和錦繡龍蝦(Panulirus ornatus)(NC014854)[17-19])的序列進行序列比對, 選取保守性較高的區域, 利用Primer 5.0 軟件設計了19對PCR引物(表 1), 覆蓋雜色龍蝦線粒體基因組全序列, 引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。

1.4 PCR擴增

PCR 反應體系: 反應總體積為 25 μL, 其中,10×Buffer 2.5 μL, dNTP2 μL, 上下游引物各 1 μL,TaqDNA聚合酶0.15 μL, DNA模板1 μL, 去離子水18.35 μL。反應程序為: 95℃預變性3 min; 94℃變性20 s, 48～58℃退火50 s, 72℃延伸90 s, 35個循環; 最后72℃延伸10 min。

1.5 擴增產物的純化回收及測序

取PCR產物2 μL在1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳, 凝膠成像儀拍照記錄。用QIAquick Gel Extraction 50柱式膠回收試劑盒純化擴增產物, 純化的步驟按試劑盒說明書進行。取適量純化產物作為測序反應的模板, 委托上海生工生物技術服務有限公司進行測序。

1.6 序列拼接及分析

所測得序列用Lasergeneversion 7.0(DNASTAR)軟件包進行分析, 用Seqman對重疊群進行拼接, 然后用Clustal W軟件對拼接后的序列進行人工校對。參考中國龍蝦、日本龍蝦和錦繡龍蝦的線粒體基因組 DNA數據對所獲得序列的蛋白編碼基因、rRNA和tRNA基因進行識別, 并通過tRNAscan-SE搜索服務器(http: //lowelab.ucsc.edu/t RNAscan-SE/)[20]進行識別tRNA的再驗證。利用MEGA5.0[21]分析各種區段的堿基組成特征, 密碼子使用頻率, 通過 DnaSP 4.10.7[22]分析龍蝦屬線粒體基因組的編碼基因多態位點和基因變異特征。

2 結果與分析

2.1 雜色龍蝦線粒體基因組全序列的基本特征

雜色龍蝦mtDNA全長為15 700 bp(GenBank登錄號為JQ320274), 由13個蛋白質編碼基因、22個tRNA基因、2個rRNA基因(16S rRNA和12S rRNA)以及D-loop控制區組成(表2)。其中14個基因位于輕鏈(L)上, 分別為12S rRNA, 16S rRNA,nad1,nad4L,nad4,nad5,tRNAVal,tRNALeu-CUN,tRNAPro,tRNAHis,tRNAPhe,tRNACys,tRNATyr,tRNAGln, 其余23個基因位于重鏈(H)上。

表2 雜色龍蝦線粒體基因組組成Tab.2 Gene organization of P. versicolor mitochondrial genome

雜色龍蝦線粒體基因組存在11處基因重疊, 重疊區長度1～6 bp不等, 基因間隔有10處, 大小在1 ～36 bp,基因間隔最大的在tRNASer與nad1和nad1與tRNALeu之間, 分別是 17 bp和 36 bp; 既沒有重疊,也沒有間隔的基因共計15處。雜色龍蝦線粒體DNA的堿基組成具有AT偏好性, A+T含量為67%, 4種堿基的含量分別為(A=34.6%, T=32.1%, C=20.5%, G=12.8%), 變化趨勢與其他甲殼動物基本一致, A含量最高而G含量最低, 在A+T富集區表現更為明顯。

線粒體基因排列能夠提供重要的系統進化信息,一般而言, 泛甲殼動物的線粒體基因組的基因排列順序基本相同, 但十足目較為復雜。作者研究的雜色龍蝦保持了泛甲殼動物線粒體基因組的原始排列,沒有出現重組/隨機丟失現象。

2.2 蛋白編碼基因

在雜色龍蝦線粒體基因組中, 參與蛋白質編碼的基因有13個(表3), 核苷酸共11140 bp, 占全序列的70.96%。雜色龍蝦的atp6與atp8之間和nad4與nad4L之間的重疊情況一致, 均重疊 7個堿基。除cox1和nad2外, 其余的11個蛋白質編碼基因都以標準的ATN作為起始密碼子。nad2的起始密碼子為GTG,cox1的起始密碼子為ACG。除atp6、atp8、cox3、nad1、nad2、nad4L和nad6的終止密碼子是TAA外, 其余的終止密碼子為不完全的T或TA,在后生動物中這種不完全密碼子比較常見。Ojala等[23]的研究表明, 成熟的終止密碼子 TAA 可以通過轉錄后的多腺苷酸化產生。

表3 雜色龍蝦粒體基因組13個蛋白編碼基因密碼子使用情況Tab.3 Average codon frequencies and usage in the 13 mitochondrial protein-coding genes in P. versicolor

2.3 tRNA基因與rRNA基因

雜色龍蝦mtDNA序列與其他物種一樣, 也包含22個tRNA基因。除tRNALeu和tRNASer有2個, 其他18個均只有1個序列。每個tRNA均能折疊成三葉草狀二級結構, 長度為61～75 bp不等。12s rRNA基因位于tRNAVal和 D-loop之間, 長度為 861 bp, 16s rRNA基因位于tRNALeu和tRNAVal之間, 長度為1 460 bp。兩個rRNA基因都位于輕鏈上, 其方向與龍蝦屬的其他物種完全一致。本研究成功地預測出 18個tRNA基因的二級結構和兩個rRNA基因的二級結構。預測到的12s rRNA的二級結構含有3個結構域, 40個莖環結構, 它的3'端存在一個莖環結構; 16s rRNA二級結構都有6個結構域, 53個莖環結構。

在相近種種間或種內的遺傳變異分析研究中,選取分子標記片段至關重要。本研究在中國龍蝦, 雜色龍蝦, 波紋龍蝦 3個物種線粒體基因組全序列基礎上分析了龍蝦屬線粒體基因組13個蛋白質編碼基因、D-loop及2個核糖體RNA 基因的多態位點分析(表 4)。結果顯示: 多態位點比例較大的基因有nad2、nad4、nad5、Cytb、D-loop。

3 討論與結論

3.1 雜色龍蝦線粒體基因組全序列

雜色龍蝦線粒體基因組序列全長15 700 bp, 稍大于中國龍蝦[18]的15 677 bp, 而稍小于日本龍蝦[17]的15 717 bp, 在軟甲亞綱的范圍內。雜色龍蝦線粒體基因組的基因排列次序與其他龍蝦類及節肢動物的基本模式相同, 沒有KD倒置現象, 即tRNAAsp(D)排在tRNALys(K)基因上游(DK排列)[24]。雜色龍蝦線粒體DNA的堿基組成具有很強的 AT偏好性, A+T含量為 67%, 稍高于中國龍蝦的 65.6%和日本龍蝦的64.5%。4種堿基的含量分別為(A=34.6%, T=32.1%,C=20.5%, G=12.8%), 變化趨勢與其他甲殼動物基本一致, A含量最多而G含量最少, 在A+T富集區表現更為明顯, 這與線粒體含有大量 ATP有著密切的聯系。蛋白質基因nad4和nad4L,atp6、atp8和cox3緊密相連, 沒有tRNA基因的間隔, 這也說明存在于蛋白質編碼基因間的tRNA二級結構是多順反子, 在轉錄過程中不進行蛋白質編碼基因間隔序列的形成[25]。

表4 龍蝦屬線粒體基因組13個蛋白質編碼基因、D-loop及2個核糖體RNA基因的多態位點分析Tab.4 Polymorphic loci analysis of 13 protein-coding genes, D-loop and two ribosomes RNA gene in Lobster (Panulirus) mitochondrial genome

3.2 蛋白質編碼基因

與日本龍蝦及中國龍蝦一樣, 雜色龍蝦的atp6與atp8之間和nad4與nad4L之間均重疊7個堿基。除cox1的起始密碼子為ACG、nad2的起始密碼子為GTG外, 其余的11個蛋白質編碼基因都以標準的ATN作為起始密碼子。除atp6、atp8、cox3、nad1、nad2、nad4L和nad6的終止密碼子是TAA外, 其余的終止密碼子為不完全的T或TA, 在后生動物中這種不完全密碼子比較常見。Ojala等[23]的研究表明,成熟的終止密碼子 TAA 可以通過轉錄后的多腺苷酸化產生。

從表 3可以看出, 雜色龍蝦組成蛋白質的氨基酸中按數目的多少排列分別為: Ser, Leu, Ile, Phe, Tyr,Pro, Asn, Thr, Lys, Met, Gln, Val, His, Ala, Glu, Arg,Gly, Asp, Trp, Cys。這與已知的龍蝦屬其他物種的氨基酸排列順序大致相同, 說明龍蝦屬各物種的蛋白質編碼基因序列之間的替換多為同義替換, 沒有影響所編碼的氨基酸種類。在雜色龍蝦線粒體基因組中, 占主導地位的是非極性氨基酸, 其次是極性不帶電的氨基酸。根據生物分子的相似相溶性原理可知, 其線粒體DNA所編碼的蛋白質為疏水蛋白質。另外, 從編碼同一個氨基酸不同密碼子的使用個數和百分比來看, 三聯密碼子的第三位點有 4種擺動形式, 第三位點為 G的密碼子使用個數較少, 這也反映了線粒體蛋白質編碼基因在使用密碼子上的明顯偏好, 即反G偏倚。

3.3 tRNA基因與rRNA基因

雜色龍蝦 mtDNA也編碼 22個tRNA基因。tRNALeu和tRNASer有 2個序列, 其他 18個均只有 1個序列。長度范圍為 61～75 bp。所預測到的二級結構, 僅tRNASer無DHC臂, 由7個核苷酸取代了該位置, 其余的tRNA都能形成典型的三葉草結構, 這是后生動物線粒體基因組的一個普遍特征。雜色龍蝦的18個tRNA的二級結構中出現16處錯配, 其中14處為 GU錯配, 2處 UU錯配, 發生在tRNATyr和tRNAGln的氨基酸接受臂和TψC臂。有學者認為線粒體基因組tRNA基因的部分錯配可以通過RNA編輯校正, 不會引起氨基酸轉運上的障礙[26]。12s rRNA基因位于tRNAVal和D-loop之間, 長度為861bp, 16s rRNA基因位于tRNALeu和tRNAVal之間, 長度為1 460 bp。兩個rRNA基因都編碼在輕鏈上, 其方向與龍蝦屬的其他物種完全一致[17-18]。預測到的雜色龍蝦 16s rRNA二級結構, 有6個結構域, 53個莖環結構; 12srRNA的二級結構含有 3個結構域, 40個莖環結構,它的3'端存在一個莖環結構, Cannone等[27]認為12s rRNA和類似12srRNA的二級結構都存在該莖環結構。雜色龍蝦的rRNA二級結構與其他脊椎動物的基本相同[28], 這說明rRNA基因進化非常慢, 在相當長的進化過程中, 其分子的排列變化不大, 功能幾乎保持恒定。

3.4 A+T富集區

目前對A+T富集區域的關注主要集中于所包含的與復制相關的調控信息。由于其在進化過程中選擇壓力相對較小, 較線粒體其他區域具有更高的多態性, 不同種類動物線粒體DNA大小的差異主要是由該區域的變化造成的[29]。雜色龍蝦控制區與其他后生動物的相似, 主要包括5個結構: 輕鏈復制起點(origin of minoritystrand replication)、poly T(poly-thymidine stretch)結構、高度變異區、類似微衛星的重復序列以及靠近tRNAIle上游的一段 poly T結構[30-31],這段Poly(T)結構, 與復制起點的識別有關[32]。

3.5 基因多態位點分析

通常cox1、Cytb被認為適用于近緣物種的區分和鑒定, 在群體遺傳、分類學、系統進化、動物保護生物學以及古生物化石等研究方面得到了廣泛的應用[33-35]。本研究中, 通過對多態位點的分析得知:cox1的多態位點比例較低, 不適宜用于龍蝦類分子進化研究。nad2、D-loop基因的多態位點比例較高, 尤其是D-loop, 高達39.50%, 且基因片段較長, 而nad5基因擁有的多態位點總數最多(>400), 因此, 他們比較適合作為分子標記用于分析龍蝦類生物進化過程中的譜系發生和遷移流動以及群體間線粒體基因組進化全序列比較分析、系統發育進化、種內多態性研究、遺傳分化等。

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