螺旋藻藻藍蛋白萃取條件的響應曲面優化

金怡雯，謝友坪，吳意珣，盧英華，敬科舉

（廈門大學化學化工學院，福建 廈門361005）

螺旋藻（Spirulina platensis）是一種生長在熱帶及亞熱帶堿性湖泊中的微藻類植物，富含各種營養物質及活性成分［1］，被聯合國糧食與農業組織稱之為“21世紀人類最理想的天然保健食品”［2］.螺旋藻屬藍藻門（Cyomophyta）顫藻科（Oscilatoriaceae），又稱藍細菌，具有蛋白含量高、繁殖快等特點，藻粉中藻藍蛋白含量高達20%［3］.

藻藍蛋白是由脫輔基蛋白與藻藍膽素（開鏈線性四吡咯）共價結合而成，其基本結構由α亞基（17 000u）和β亞基（19 500u）構成單聚體（αβ），然后單聚體間通過連接肽構成三聚體（αβ）3或者六聚體（αβ）6［4－5］.大量實驗表明，螺旋藻藻藍蛋白具有提高人體免疫力［6］、促進動物血細胞再生［7］、抑制癌細胞生長［8］等作用，同時在抗輻射、抗疲勞、清除自由基［9］等方面也具有一定的生理活性.目前國內外對藻藍蛋白提取過程中細胞破碎方法主要有：化學試劑處理法、溶脹法、凍融法和超聲波法，其中凍融法和超聲法效果較好［10］.而Chen等［11］使用直接的滲透壓法也得到了較高的藻藍蛋白得率，且此法與其他方法相比操作簡單快捷.諸多因素影響螺旋藻藻藍蛋白的萃取效果，其中質量濃度、萃取時間和萃取溫度對藻藍蛋白的萃取效果影響較為顯著［12］.本文對這3個因素進行考察，用響應曲面（response surface methodolo－gy，RSM）模型設計試驗，對螺旋藻藻藍蛋白萃取工藝進行優化，得到藻藍蛋白的最佳萃取條件.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藻株：螺旋藻（FACHB－314），購自中科院武漢水生生物研究所.

螺旋藻粉，本實驗室培養的螺旋藻體冷凍干燥所得；所有化學試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；水為去離子水.

FD－1000冷凍干燥機，上海愛朗儀器有限公司；JA403電子天平，上海?？惦娮觾x器廠；SKY－200B搖床，SUKUN；D－78532臺式冷凍離心機，ZENTRIFUGEN；UV－1800紫外可見分光光度計，SHIMADZU CORPORATION.

1.2 實驗方法

1.2.1 提取與分析

取2～10mg／mL的螺旋藻粉，加入10mL磷酸鹽緩沖液（0.15mol／L，pH 值7.0），混勻后在某一固定溫度下靜置12～60h，離心（10 370 g，5min）后得到清透的藍色上清液，在620與652nm處測定液體的吸光度，根據下式［13］計算藻藍蛋白的濃度：

式中，ρ（C－PC），藻藍蛋白質量濃度（g／L）；A620，樣品在620nm處的吸光值；A652，樣品在652nm處的吸光值.

根據下式計算藻體中藻藍蛋白得率：

式中，Y，藻藍蛋白得率（%）；V，磷酸鹽緩沖液體積（L）；M，螺旋藻粉質量（g）.

1.2.2 單因素試驗

1）萃取時間對藻藍蛋白得率的影響

在溫度為25℃，螺旋藻粉質量濃度為6mg／mL的條件下研究不同萃取時間對藻藍蛋白得率的影響.如圖1（a）所示，在萃取時間從12h增加到60h的過程中，藻藍蛋白得率先上升后下降.當萃取時間為36 h的時候，藻藍蛋白得率達到最高值.隨著萃取時間的增加，螺旋藻細胞逐漸破碎釋放出自身的藻藍蛋白，所以其得率逐漸增加；當達到一定的值后，再延長萃取時間，藻藍蛋白得率反而有所下降，這可能是因為隨著萃取時間的延長，藻藍蛋白全部釋放出來之后發生一定程度上的自我降解.因此，選用36h作為藻藍蛋白萃取時間的最優值做進一步優化.

2）萃取溫度對藻藍蛋白得率的影響

在萃取時間為36h，螺旋藻粉質量濃度為6mg／mL的條件下研究不同萃取溫度對藻藍蛋白得率的影響.如圖1（b）所示，萃取溫度在一定的范圍內（13～37℃）呈現先上升后下降的趨勢，在25℃時藻藍蛋白得率最高，達到13.37%.在萃取溫度從13℃升高到25℃的過程中，藻藍蛋白得率迅速上升，而超過25℃以后，變化不明顯甚至有略微下降.故選擇25℃為藻藍蛋白萃取的最佳溫度點進行進一步優化.

3）質量濃度對藻藍蛋白得率的影響

在萃取時間為36h，萃取溫度為25℃的條件下研究不同螺旋藻粉質量濃度對藻藍蛋白得率的影響.如圖1（c）所示，在螺旋藻粉質量濃度從2mg／mL增加到10mg／mL的過程中，藻藍蛋白得率變化較小，略微呈現少許的下降趨勢，這說明螺旋藻粉自身的質量濃度可能相對于其他因素而言，對藻藍蛋白得率的影響較小.

1.2.3 RSM 試驗設計

采用三因素的Box－Behnken設計（BBD）優化萃取工藝參數，以質量濃度、萃取時間和萃取溫度3個因素為自變量，藻藍蛋白得率為響應值設計三因素三水平的RSM試驗.根據單因素試驗結果，規定了3個因素的變動范圍及中心點值（表1）.BBD有17個析因點，其中有5個重復的中心點（表2），采用Design Expert軟件分析實驗數據.

表1 Box－Behnken設計的因素與水平Tab.1 Factors and levels of Box－Behnken design

2 結果與分析

2.1 試驗設計及結果

采用Design Expert軟件對表2的試驗結果進行回歸擬合，得到藻藍蛋白得率對3個因素的多元二次回歸模型：

2.2 RSM結果分析

從二次響應面回歸模型的方差分析結果可知，回歸模型極顯著（p＝0.000 6＜0.01）、失擬項不顯著（p＝0.135 2＞0.05）、R2＝0.955 0、＝0.897 1、CV＝4.37，這些數據表明回歸方程擬合度和可信度均很高，能很好地對最優工藝條件進行預測.

圖1 萃取時間（a）、萃取溫度（b）、質量濃度（c）對藻藍蛋白得率的影響Fig.1 Effect of different extraction time（a），extraction temperature（b），solid－to－liquid ratio（c）on extraction yield

表2 Box－Behnken試驗設計與試驗結果Tab.2 Results of Box－Behnken design

由回歸方程系數顯著性檢測結果可知，試驗中一次項 A 極 顯 著 （p 值 ＜0.01），B、C 顯 著 （p 值 ＜0.05）；二次項A2不顯著，B2、C2極顯著；交互項AB、AC不顯著，BC極顯著.

2.3 各因素之間的交互作用

根據Box－Behnken試驗結果做RSM圖，考察擬合的RSM的形狀，分析螺旋藻粉質量濃度、萃取時間、萃取溫度三者之間交互作用對藻藍蛋白得率的影響，其RSM和等高線如圖2～4所示.各因素及交互作用對響應值的影響結果以圖2～4直觀地反映出來.

圖2 質量濃度與萃取時間對藻藍蛋白得率影響的RSM（a）及等高線（b）Fig.2 Response surface（a）and contour line（b）of interaction effect of solid－to－liquid ratio and extraction time on C－PC extraction yieid

從RSM中可以看出，萃取時間和萃取溫度之間的交互作用對藻藍蛋白得率的影響最為顯著，在姚毅等［14］、佟萬兵等［15］和孫長霞等［16］的研究結果中，萃取時間和萃取溫度之間的交互作用對所萃取物質得率的影響也很顯著.從圖4可以看出，一定范圍內，藻藍蛋白得率隨萃取時間和萃取溫度的增加而提高，兩者交互作用顯著.根據動力學理論，時間的延長有利于藻藍蛋白的充分擴散析出，同時溫度的提高使得分子解附和擴散運動速率加快、水溶液黏度和傳質阻力降低以及化合物之間的結合削弱，從而增加了藻藍蛋白的析出速率及其得率.因此，適當增加萃取時間和萃取溫度有助于提高藻藍蛋白的得率.

另外，從圖3可以看出，質量濃度和萃取溫度之間的交互作用對藻藍蛋白得率的影響次之.質量濃度不變萃取溫度增加，藻藍蛋白得率逐漸增大到最大值然后下降；而萃取溫度不變質量濃度增加，藻藍蛋白得率呈現略微下降的趨勢，這和之前單因素試驗結果的分析相吻合.Chaiklahan等［17］的研究表明，在螺旋藻多糖的萃取過程中質量濃度越低多糖析出效果越好，因為高的含水量有利于多糖的分散，促進多糖離開固體顆粒表面，同時增強了溶劑擴散進入細胞內，因此提高了萃取效率，這和本文中藻藍蛋白得率隨質量濃度增加而略微下降的結果相似.質量濃度的增加并未取得更好的萃取效果，也可能是由于在萃取溶液中溶質已達到完全飽和［18］.

2.4 優化工藝結果

利用Design Expert軟件對模型方程求解，對回歸方程求一階偏導并使之等于0，解得A＝2.996，B＝－0.034，C＝1.716，為曲面最大點，所對應各因子的量分別為螺旋藻粉質量濃度2.00mg／mL，萃取時間37.14h，萃取溫度25.61℃，此條件下藻藍蛋白得率Y理論值為13.72%.

圖3 質量濃度與萃取溫度對藻藍蛋白得率影響的響應面（a）及等高線（b）Fig.3 Response surface（a）and contour line（b）of interaction effect of solid－to－liquid ratio and extraction temperature on C－PC extraction yieid

圖4 萃取時間與萃取溫度對藻藍蛋白得率影響的響應面（a）及等高線（b）Fig.4 Response surface（a）and contour line（b）of interaction effect of extraction time and extraction temperature on C－PC extraction yieid

按照模型預測的最優條件，根據實際情況，在螺旋藻粉質量濃度為2.0mg／mL、萃取時間為37.1h、萃取溫度為25.6℃的工藝條件下進行驗證性試驗，得到的藻藍蛋白得率（13.66±0.87）% （n＝3）和預測值吻合較好，表明該模型工藝參數準確可靠，能較好地預測實際情況.

相關研究表明，超聲波提取法藻藍蛋白得率為10.76%，凍融法藻藍蛋白得率為7.89%，以及恒溫浸提法藻藍蛋白得率為6.57%［12］.而采用本文優化之后的直接滲透壓法藻藍蛋白得率可達到13.66%，該值要明顯高于文獻報道的結果.另外，優化之前的萃取工藝條件為：質量濃度10.0mg／mL、萃取時間21h和萃取溫度4℃，在此條件下萃取得到的藻藍蛋白得率為10.29%.與之相比較，萃取工藝條件優化后其藻藍蛋白含量提高了32.8%.雖然萃取時間較長，但萃取溫度更接近室溫，因此降低了能耗，更節約成本.

3 結 論

1）在單因素試驗的基礎上，選取質量濃度、萃取時間和萃取溫度3個因素進行RSM的Box－Behnken設計，采用Design Expert軟件進行回歸擬合，建立藻藍蛋白得率工藝數學模型：Y＝12.74－1.36A＋0.44B＋0.59C ＋0.26AB ＋0.44AC －1.25BC －0.40A2－1.24B2－0.88C2.回歸分析表明，該模型的穩定性較好；通過模型系數顯著性檢驗，萃取時間和萃取溫度的交互作用對藻藍蛋白得率的影響最為顯著.

2）由RSM試驗，優化了螺旋藻藻藍蛋白的萃取工藝，分析結果得到萃取的最佳工藝條件為：質量濃度2.0mg／mL、萃取時間37.14h和萃取溫度25.61℃.在此條件下藻藍蛋白得率可達到13.66%，較優化前提高了32.8%.

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