復方萘甲唑啉滴眼液無菌檢查方法的驗證

余曉霞 劉春霞 李磊

復方萘甲唑啉滴眼液為中山大學孫逸仙紀念醫院配制的眼用制劑, 其主要成分為鹽酸萘甲唑啉、馬來酸氯苯那敏、硼酸和羥苯乙酯等, 具有減輕眼睛刺激感和結膜充血的作用,臨床適用于過敏性引起的眼睛炎癥。《中國藥典》2010年版［1］首次將無菌檢查納入眼用制劑檢查項下。因此, 需建立復方萘甲唑啉滴眼液無菌檢查方法并進行驗證。

1 儀器與材料

1.1 儀器 一次性全封閉無菌集菌過濾器(北京牛牛基因科技有限公司)、WJ-6無菌檢查儀(天津羅根科技)、303A-1生化培養箱(上海浦東榮豐科學儀器有限公司)、SPX-100B生化培養箱(上海悅豐儀器儀表有限公司)。

1.2 試藥 營養瓊脂培養基(批號：140308), 玫瑰紅鈉瓊脂培養基(批號：140228), 營養肉湯培養基(批號：130521),改良馬丁培養基(批號：1401222), 改良馬丁瓊脂培養基(批號：130910), 硫乙醇酸鹽流體培養基(批號：1401152), 0.1%蛋白胨水溶液(批號：110221)。以上均來源于北京三藥科技開發公司。復方萘甲唑啉滴眼液(規格：10ml/瓶, 批號：201310228、201310238、201401178, 中山大學孫逸仙紀念醫院 )。

1.3 菌種 大腸埃希菌(escherichia coli)［CMCC(B)44 102］,枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)［CMCC(B)63 501］, 金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)［CMCC(B)26 003］, 生孢梭菌(clostridum sporogens)［CMCC(B)64 941］, 白色念珠菌(candida albicans)［CMCC(F)98 001］, 黑曲霉(aspergillus niger)［CMCC(F)98 003］, 銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa)［CMCC(B)10 104］(以上菌種的凍干菌均購自中國食品藥品生物檢定研究院 )。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 取經30～35℃培養18～24 h的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的肉湯培養物和生孢梭菌硫乙醇酸鹽液體新鮮培養物, 取經23～28℃培養24～48 h的白色念珠菌液體培養物, 分別用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每毫升含菌數<100 cfu的菌懸液。取經23～28℃ 培養1周的黑曲霉斜面培養物, 加入3～5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液, 將孢子洗脫。然后, 用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內, 用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每毫升含孢子數<100 cfu的孢子懸液。

2.2 最少檢驗數量、檢驗量的確定 供試品的裝量為10 ml,按《中國藥典》2010版二部附錄Ⅺ H無菌檢查法, 結果見表1,最少檢驗數量應為10個；按表2, 每支供試品接入每種培養基的最少量為2 ml。

2.3 供試品管的制備 取供試品30支(批號：201310228、201310238、201401178)分2份, 15支/份, 用兩套一次性三聯管全封閉無菌集菌過濾器, 先用少量0.1%無菌蛋白胨水溶液濕潤濾膜, 調節集菌儀轉速為160 r/min, 按薄膜過濾法全量過濾, 每膜用0.1%無菌蛋白胨水溶液300 ml分3次沖洗 , 在最后50 ml沖洗液中加入菌液1 ml［2］, 過濾至干 , 作為供試品管。

2.4 對照管的制備 取過濾器, 加入50 ml 0.1%無菌蛋白胨水溶液, 加入相應的菌液1 ml, 濾干, 作為對照管。

2.5 無菌檢查方法的驗證 分別取含大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和生孢梭菌的供試品管, 各加入硫乙醇酸鹽流體培養基100 ml；含白色念珠菌和黑曲霉的供試品管, 各加入改良馬丁培養基100 ml, 置相應培養溫度培養。取對照管6管, 其中4管分別加入硫乙醇酸鹽流體培養基100 ml, 再分別加入大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌和生孢梭菌菌液各1 ml；另2管分別加入改良馬丁培養基100 ml, 再分別加入白色念珠菌和黑曲霉菌液各1 ml,置相應培養溫度培養。同時, 取上述菌液各1 ml, 按微生物限度檢查法(平皿法)(中國藥典2010版二部附錄Ⅺ H)計數,每個菌株平行制備2個平皿, 生孢梭菌用硫乙醇酸鹽流體培養基作液體計數, 測定所加菌數。結果見表1。

表1 驗證結果

3 小結

由于復方萘甲唑啉滴眼液處方中含有羥苯乙酯和硼酸,均有抑菌作用, 因此實驗初始沖洗量選擇了300 ml。由表1結果可見, 與對照管比較, 供試品管中的試驗菌均生長良好,說明供試品在薄膜過濾法的檢驗條件下無抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計, 可照此檢查方法和檢查條件進行復方萘甲唑啉滴眼液的無菌檢查。

［1］國家藥典委員會.中國藥典(二部).中國醫藥科技出版社,2010：附錄XI H.

［2］張新妹, 胡昌勤, 趙霞, 等.注射用伏立康唑無菌檢查法的建立.天津藥學, 2003, 15(5):9-11.