特應(yīng)性皮炎患者皮膚屏障與水閘蛋白1表達(dá)的相關(guān)性研究

袁超 錢春艷 楊麗潔 王學(xué)民

特應(yīng)性皮炎患者皮膚屏障與水閘蛋白1表達(dá)的相關(guān)性研究

袁超 錢春艷 楊麗潔 王學(xué)民

目的研究特應(yīng)性皮炎(AD)患者皮膚屏障功能情況,并分析其與水閘蛋白1(claudin-1)表達(dá)的相關(guān)性。方法納入AD患者和健康人各11例。應(yīng)用皮膚經(jīng)表皮失水率測(cè)定儀和皮膚高頻超聲檢測(cè)儀測(cè)定受試者經(jīng)表皮失水率、表皮厚度與表皮致密度,并用雙抗體夾心ELISA法定量檢測(cè)血清中脫落claudin-1表達(dá)量。應(yīng)用單因素方差分析和t檢驗(yàn)比較不同組別之間相關(guān)參數(shù)的差異;應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)分析不同參數(shù)之間的相關(guān)性。結(jié)果AD患者皮疹部位經(jīng)表皮失水率為(36.9±34.2)g·m-2·h-1,非皮疹部位為(9.1±6.0)g·m-2·h-1,均高于健康對(duì)照[(4.4 ± 3.1)g·m-2·h-1];AD 患者皮疹部位表皮厚度(0.23 ± 0.04)mm,顯著高于非皮疹部位[(0.18±0.03)mm]和健康對(duì)照[(0.18±0.02)mm]。AD患者皮疹部位有其特征性表皮下低回聲帶。AD患者claudin-1表達(dá)量為(0.80±0.88)ng/ml,顯著低于健康人[(1.73±1.85)ng/ml];claudin-1與表皮厚度顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.61),與經(jīng)表皮失水率的倒數(shù)顯著正相關(guān)(r=0.44)。結(jié)論AD患者損傷的皮膚屏障功能與claudin-1表達(dá)相關(guān),屏障功能狀態(tài)可用經(jīng)表皮失水率、經(jīng)表皮失水率倒數(shù)和表皮厚度進(jìn)行定量表述。

皮炎,特應(yīng)性;皮膚屏障;Claudin-1;緊密連接蛋白質(zhì)類

作者單位:200443上海市皮膚病醫(yī)院皮膚與化妝品研究室

遺傳性或獲得性皮膚屏障功能障礙在特應(yīng)性皮炎(AD)發(fā)病中起著重要作用[1]。皮膚物理性屏障主要包括兩個(gè)重要結(jié)構(gòu):角質(zhì)形成細(xì)胞和緊密連接(tight junction,簡(jiǎn)稱TJ)[2]。TJ是物理屏障中一種細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接結(jié)構(gòu),它是滲透性阻隔的有效成分,其結(jié)構(gòu)完整性直接關(guān)系到皮膚屏障功能。水閘蛋白1(claudin-1)是TJ中跨膜蛋白之一,它與角質(zhì)形成細(xì)胞共同維持皮膚屏障功能和柵欄功能[3]。早在2002年,Furuse等[4]就報(bào)道在claudin-1缺陷小鼠上,可觀察到皮膚角質(zhì)層形態(tài)學(xué)改變,且該小鼠在出生24 h內(nèi)死亡,伴有嚴(yán)重缺水癥狀、經(jīng)表皮失水率(TEWL)增高、皮膚黏合力降低。本研究的目的是探討AD患者皮膚屏障功能的評(píng)價(jià)方法,claudin-1表達(dá)在AD患者和健康人之間的差異以及claudin-1與哪些非創(chuàng)傷檢測(cè)參數(shù)相關(guān)等。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

按照Williams診斷標(biāo)準(zhǔn),入選成人AD患者11例,上述患者均處于疾病緩解期(試驗(yàn)中將緩解期定義為近1周內(nèi)無(wú)新發(fā)皮疹,之前皮疹尚可辨別)。AD組中,男7例,女4例,平均病程(11.1±9.7)年,年齡21～31歲,平均(26.3±3.6)歲;按同樣年齡與性別,配比健康志愿者11例,AD組與對(duì)照組在年齡與性別比方面完全一致。該試驗(yàn)通過(guò)上海市皮膚病醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),每例受試者在試驗(yàn)前簽署知情同意書(shū)。

二、材料與方法

1.儀器與試劑:皮膚經(jīng)表皮失水率測(cè)定儀(Tewameter 210,德國(guó)Courage+Khazaka公司),皮膚高頻超聲檢測(cè)儀(Ultrasonic UC22,德國(guó)Courage+Khazaka公司);ELX800吸收光酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司),claudin-1檢測(cè)試劑盒(武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司),產(chǎn)品編號(hào)為E92388Hu 96T。

2.方法:

(1)AD患者皮疹嚴(yán)重程度評(píng)估:應(yīng)用濕疹面積和嚴(yán)重度指數(shù)(eczema area and severity index,EASI)。具體方法:評(píng)估頭頸部(10%)、上肢(20%)、軀干(30%)和下肢(40%)受累面積、紅斑、丘疹、鱗屑、苔蘚樣變、瘙癢程度,每處評(píng)分計(jì)為0～3分,0分為無(wú),1分為輕度,2分為中度,3分為重度。累加計(jì)算每例患者EASI總分分值。

(2)TEWL檢測(cè):應(yīng)用TEWL測(cè)定儀分別測(cè)定患者3處不同皮疹處及其所對(duì)應(yīng)的非皮疹處(皮疹周邊正常皮膚處),并通過(guò)TEWL值計(jì)算1/TEWL值;同時(shí)檢測(cè)健康對(duì)照相應(yīng)部位皮膚。

(3)皮膚表皮厚度(ET)與致密度(ED)檢測(cè):應(yīng)用皮膚高頻超聲檢測(cè)儀對(duì)患者一處皮疹進(jìn)行圖像掃描,并通過(guò)其軟件分析并測(cè)定ET與ED值;同時(shí)檢測(cè)健康對(duì)照相應(yīng)部位皮膚。

(4)血claudin-1含量測(cè)定:運(yùn)用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定。抽取AD患者和健康人外周靜脈血全血,分離血清,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,讀取A450值,據(jù)此計(jì)算claudin-1含量。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行分析。單因素方差分析比較患者皮疹、非皮疹以及健康人之間TEWL、ET和ED差異。應(yīng)用t檢驗(yàn)比較AD患者和健康人之間血清脫落claudin-1的差異。應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)分析各參數(shù)之間相關(guān)性。

結(jié) 果

一、一般情況

AD患者中,6例出現(xiàn)嗜酸性粒細(xì)胞百分率增高(＞正常值5%),9例出現(xiàn)IgE高于正常參考值(165 IU/ml),4例既往有哮喘病史,4例有過(guò)敏性鼻炎病史。患者濕疹面積和嚴(yán)重度指數(shù)的分值最高為44.1,最低為12.2。健康對(duì)照組,嗜酸性粒細(xì)胞百分率和IgE均在正常水平,且均無(wú)哮喘或過(guò)敏性鼻炎病史。

二、皮膚屏障功能評(píng)估情況

1.TEWL、ET、ED情況:見(jiàn)表1。AD患者皮疹處TEWL顯著高于其非皮疹處(P＜0.05),而非皮疹處TEWL顯著高于健康對(duì)照同一檢測(cè)部位(P＜0.05)。AD患者皮疹處ET顯著高于非皮疹處和健康對(duì)照(均P＜0.01),AD患者非皮疹處與健康人同一部位差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。AD患者皮疹處ED值與其對(duì)應(yīng)的正常皮膚以及健康對(duì)照皮膚相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

2.AD患者皮疹處特征性改變:有明顯的“表皮下低回聲區(qū)域(sub-epidermal low echogenic band,SLEB)”,該SLEB寬度甚至大于其相應(yīng)的表皮厚度,而在AD患者正常皮膚處及健康對(duì)照同一部位不存在該SLEB。見(jiàn)圖1。

表1 AD患者和健康人皮膚TEWL、ET和ED值比較(±s)

表1 AD患者和健康人皮膚TEWL、ET和ED值比較(±s)

注:AD:特應(yīng)性皮炎;TEWL:經(jīng)表皮失水率;ET:表皮厚度;ED:表皮致密度;與AD皮疹處比較,a:P＜0.05;b:P＜0.01;與AD正常皮膚比較,c:P＜0.05

TEWL(g·m-2·h-1)ET(mm)ED(g/mm2)36.9±34.2 0.23±0.04 140.4±20.7 9.1±6.0a 0.18±0.03b 156.1±17.3 4.4±3.1ac 0.18±0.02b 152.5±16.0 8.356 9.795 2.292例數(shù)AD皮疹處 11 AD正常皮膚 11健康人皮膚 11 F值

三、claudin-1與皮膚屏障功能各參數(shù)之間的相關(guān)性分析

1.claudin-1在AD患者中表達(dá)量為(0.80±0.88)ng/ml,而健康人為(1.73±1.85)ng/ml,AD患者的表達(dá)量顯著低于健康人(t=2.536,P＜0.05)。claudin-1與1/TEWL呈正相關(guān)(r為0.44,P＜0.05),與ET負(fù)相關(guān)(r為-0.61,P＜0.01),即角質(zhì)層越厚,claudin-1表達(dá)越低;claudin-1與TEWL之間的r為-0.26,與ED的r為0.40,但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。

皮膚屏障功能各參數(shù)之間相關(guān)情況為:TEWL與ET呈正相關(guān)(r為0.74,P＜0.01),與ED負(fù)相關(guān)(r為-0.46,P＜0.05);1/TEWL和ET負(fù)相關(guān)(r為-0.50,P＜0.05);而ET和ED負(fù)相關(guān)(r為-0.53,P＜0.05)。

圖1 特應(yīng)性皮炎患者和健康人不同部位皮膚高頻超聲圖像比較 1a:AD患者皮疹部位可見(jiàn)明顯表皮下低回聲區(qū)域(箭頭);1b:患者正常部位無(wú)明顯表皮下低回聲區(qū)域,可見(jiàn)表皮輕度變薄;1c:健康對(duì)照皮膚

討 論

De Benedetto等應(yīng)用免疫組化方法測(cè)定AD患者非皮疹部位TJ蛋白含量,發(fā)現(xiàn)claudin-1和claudin-23表達(dá)量均顯著降低,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)claudin-1單型體頂端的單核苷酸多態(tài)性[5]。這些都證實(shí)AD患者的確存在claudin-1缺陷,并進(jìn)而導(dǎo)致皮膚屏障功能障礙。在銀屑病患者的皮疹中,研究發(fā)現(xiàn)claudin-1和claudin-4在患者和正常人中沒(méi)有差異,但claudin-5在顆粒層中出現(xiàn)異常表達(dá)[6]。新近對(duì)于“新生兒魚(yú)鱗病硬化性膽管炎”(neonatal ichthyosis-sclerosing cholangitis)的報(bào)道,更說(shuō)明claudin-1缺陷不但表現(xiàn)于皮膚組織,還可遷延至其他器官或組織,引起更為嚴(yán)重?fù)p害[7-8]。這些都證實(shí),TJ蛋白與皮膚屏障功能之間存在緊密關(guān)聯(lián)。

本研究中,TEWL測(cè)定法和皮膚高頻B超檢測(cè)法均可以通過(guò)相關(guān)的檢測(cè)參數(shù),對(duì)AD患者和健康人進(jìn)行定量評(píng)估皮膚屏障功能。值得一提的是1/TEWL,早在1998年,Schwindt等[9]在膠帶粘貼試驗(yàn)中應(yīng)用到這個(gè)參數(shù),發(fā)現(xiàn)該參數(shù)與表皮厚度有很好的負(fù)線性關(guān)系。后來(lái)Weigmann等[10]通過(guò)430 nm分光光度儀確認(rèn),1/TEWL與皮膚表面“累積角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)”密切相關(guān)。Voegeli等[11]在AD患者的皮疹處與非皮疹處進(jìn)行了該參數(shù)的驗(yàn)證,認(rèn)為1/TEWL可以很好地表示皮膚厚度。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn):1/TEWL與表示表皮厚度的ET顯著負(fù)相關(guān),r達(dá)到-0.50,從另一個(gè)方面驗(yàn)證了之前的理論。claudin-1與TEWL相關(guān)性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而與1/TEWL顯著正相關(guān),與ET顯著負(fù)相關(guān),說(shuō)明claudin-1的表達(dá)在增厚的角質(zhì)層中是降低的,claudin-1如同黏合劑一樣,將細(xì)胞與細(xì)胞連接在一起,而claudin-1與1/TEWL顯著正相關(guān),說(shuō)明一定程度上,1/TEWL可以表示細(xì)胞之間的黏合力狀況,1/TEWL越小,細(xì)胞間黏合力越差,這對(duì)于間接了解皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞間的黏合力情況,提供了一個(gè)非創(chuàng)傷性檢測(cè)參數(shù)。

近年來(lái),皮膚B超的無(wú)創(chuàng)性、操作簡(jiǎn)單和價(jià)格低廉優(yōu)點(diǎn)使其在皮膚腫瘤、硬皮病、疤痕疙瘩、銀屑病等皮膚疾病診斷與治療判斷上都顯示出較好的應(yīng)用價(jià)值[12-13]。本研究中,AD患者B超圖像中直觀看到了“表皮下低回聲區(qū)域”,該區(qū)域形成可能與表皮下層炎性水腫及真皮上部血管擴(kuò)張有一定關(guān)聯(lián);AD患者皮疹處表皮厚度增高,而致密度降低,這和表皮角化過(guò)度及角化不全密切相關(guān)。因此皮膚B超可在一定程度上反映出皮膚病的病理狀態(tài)。claudin-1與表皮厚度顯著負(fù)相關(guān),而與致密度關(guān)系不明顯,提示我們?cè)趹?yīng)用致密度參數(shù)時(shí),需要綜合考慮皮膚的厚度情況。而TEWL參數(shù)與ET和ED參數(shù)的相關(guān)性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明這兩個(gè)參數(shù)可作為皮膚屏障功能評(píng)價(jià)方法之一。

[1]Kubo A,Nagao K,Amagai M.Epidermal barrier dysfunction and cutaneous sensitization in atopic diseases[J].J Clin Invest,2012,122(2):440-447.

[2]Kuo IH,Yoshida T,De Benedetto A,et al.The cutaneous innate immune response in patients with atopic dermatitis[J].J Allergy Clin Immunol,2013,131(2):266-278.

[3]袁超,王學(xué)民.緊密連接的結(jié)構(gòu)組成及其屏障功能研究進(jìn)展[J].國(guó)際皮膚性病學(xué)雜志,2011,37(5):297-299.

[4]Furuse M,Hata M,Furuse K,et al.Claudin-based tight junctions are crucial for the mammalian epidermal barrier:a lesson from claudin-1-deficient mice[J].J Cell Biol,2002,156(6):1099-1111.

[5]De Benedetto A,Rafaels NM,McGirt LY,et al.Tight junction defects in patients with atopic dermatitis[J].J Allergy Clin Immunol,2011,127(3):773-786.e1-e7.

[6]Peltonen S,Riehokainen J,Pummi K,et al.Tight junction components occludin,ZO-1,and claudin-1,-4 and-5 in active and healing psoriasis[J].Br J Dermatol,2007,156(3):466-472.

[7]Nagtzaam IF,van Geel M,Driessen A,et al.Bile duct paucity is part of the neonatal ichthyosis-sclerosing cholangitis phenotype[J].Br J Dermatol,2010,163(1):205-207.

[8]Feldmeyer L,Huber M,Fellmann F,et al.Confirmation of the origin of NISCH syndrome[J].Hum Mutat,2006,27(5):408-410.

[9]Schwindt DA,Wilhelm KP,Maibach HI.Water diffusion characteristics of human stratum corneum at different anatomical sitesin vivo[J].J Invest Dermatol,1998,111(3):385-389.

[10]Weigmann HJ,Ulrich J,Schanzer S,et al.Comparison of transepidermalwaterlossand spectroscopic absorbance to quantify changes of the stratum corneum after tape stripping[J].Skin Pharmacol Physiol,2005,18(4):180-185.

[11]Voegeli R,Rawlings AV,Breternitz M,et al.Increased stratum corneum serine protease activity in acute eczematous atopic skin[J].Br J Dermatol,2009,161(1):70-77.

[12]El-Zawahry MB,Abdel El-Hameed El-Cheweikh HM,Abd-El-Rahman Ramadan S,et al.Ultrasound biomicroscopy in the diagnosis of skin diseases[J].Eur J Dermatol,2007,17(6):469-475.

[13]MachetL,OssantF,BleuzenA,etal.High-resolutionultrasonography:utility in diagnosis,treatment,and monitoring dermatologic diseases[J].J Radiol,2006,87(12 Pt 2):1946-1961.

2013-07-30)

(本文編輯:尚淑賢)

Relationship between skin barrier function and claudin-1 expression in patients with atopic dermatitis

Yuan Chao,Qian Chunyan,Yang Lijie,Wang Xuemin.Skin&Cosmetic Research Department,Shanghai Skin Disease Hospital,Shanghai 200443,China

Wang Xuemin,Email:dermxmwang@126.com

ObjectiveTo evaluate skin barrier function in patients with atopic dermatitis(AD),and to assess its relationship with claudin-1 expression.MethodsTotally,11 patients with AD and 11 healthy human controls were recruited in this study.A Tewameter TM210 was used to measure transepidermal water loss(TEWL)value,and high-frequency ultrasound to determine epidermal thickness and density,in lesional and non-lesional skin of the patients and normal skin of the healthy controls.A double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to determine the serum level of free claudin-1 in these subjects.One-way analysis of variance andttest were carried out to compare these parameters in different groups,and Pearson's correlation analysis to estimate the relationship between different parameters.ResultsThe TEWL value was significantly higher in lesional skin than in nonlesional skin of patients with AD and normal skin of the healthy controls((36.9±34.2)vs.(9.1 ± 6.0)and(4.4 ± 3.1)g·m-2·h-1,bothP＜ 0.05).The epidermal thickness in AD lesions was(0.23 ±0.04)mm,significantly higher than that in nonlesional skin((0.18±0.03)mm,P＜0.01)and normal control skin((0.18±0.02)mm,P＜0.01).Ultrasound images revealed a characteristic subepidermal low echo-genic band in the AD lesions.The patients with AD showed a significantly lower serum level of claudin-1 compared with the healthy controls((0.80±0.88)vs.(1.73±1.85)μg/L,P＜0.05).Moreover,the serum level of claudin-1 was negatively correlated with epidermal thickness(r=-0.61,P＜0.01),but positively correlated with the inverse of TEWL(1/TEWL,r=0.44,P＜0.05).ConclusionsThe impaired skin barrier function,which may be evaluated by TEWL,1/TEWL and epidermal thickness,is associated with the expression of claudin-1 in patients with AD.

Dermatitis,atopic;Skin barrier;Claudin-1;Tight junction proteins

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.06.013

2011年中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)皮膚屏障修復(fù)基金

王學(xué)民,Email:dermxmwang@126.com