軟皮湯對硬皮病小鼠模型皮膚組織中p-SMAD3、FLI1因子表達的影響

齊 慶，李永賢，陳英杰，李東海，朱 珂，查旭山

（1.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院、第一附屬醫院皮膚科，廣東 廣州510405；2.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院2009 級本科班，廣東 廣州510405）

軟皮湯來源于鄧鐵濤教授治療硬皮病的理論——硬皮病治療時應以補腎益精為主，健脾養肺為輔。 軟皮湯能減輕患者皮膚硬化癥狀，其具體機制仍不明確[1-2]。 前期研究提示，在體外其作用靶向于TGF-β 通路[3-4]，可能與活化因子SMAD3、抑制因子FLI1 之間的平衡變化有關[5]。 然而，機體復雜的微環境有別于體外細胞模型，諸多因素影響細胞因子作用；因此，有必要深入開展相關體內研究。 本研究將基于小鼠硬皮病模型，繼續探討軟皮湯在體內對TGF-β 通路中SMAD3、FLI1 等因子“平衡”的影響，現將方法與結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性C57BL/6J 小鼠30 只，6～8 周齡， 體質量（20.0±1.4）g，購于中山大學實驗動物中心，合格證NO.44008500000277。

1.2 主要試藥與試劑

中藥：補腎益精復方軟皮湯處方來源于廣州中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科， 藥物組成： 阿膠10 g，山茱萸10 g，熟地黃20 g，黃芪30 g，山藥30 g，茯苓15 g，川紅花5 g。 加蒸餾水1 200 mL，浸泡20 min 后， 沸煮45 min， 過濾收集藥液。100 ℃水浴蒸發， 使藥液濃縮至134 mL （生藥量0.9 g/mL）。 博來霉素bleomycin（#9041-93-4）購于Aladin 公司。 Masson 染色試劑盒購于南京建成生物工程研究所 （#D026）。 抗體：CollagenⅠ(#sc8788)、FLI1 (#sc356) 購 于Santa cruz 公 司；Fibronectin(#ab2413) 購 于Abcam 公 司；SAMD3 （#9532），p-SMAD3（#8828），β-Actin（#3700）購于Cell signaling technology 公司。 ECL 發光試劑盒購于廣州永諾生物科技有限公司（#F0010）。

1.3 主要儀器

AB-160 型電子分析天平 （美國Denver 公司）；Power Tone XL 超薄切片機 （美國Boeckeler RMC 公司）；Olympus BXDX 光學顯微鏡 （日本Olympus 公司）；微型電泳電轉移系統（美國Bio-Rad 公司）；BX 51 光學顯微鏡照相系統 （日本Olympus 公司）；CR 21G 高速冷凍離心機 （日本Hitachi 公司）。

1.4 造模與藥物處理[6]

動物隨機分成3 組，每組10 只，實驗前在小鼠背部中央（1 cm×1 cm）剃去毛發。 正常對照組：以PBS 溶液100 μL 每日同一位點注射1 次， 生理鹽水(0.2 mL/10 g)每日灌胃1 次。模型對照組：博來霉素PBS 溶液1 mg/mL 100 μL 每日同一位點注射1次，生理鹽水(0.2 mL/10 g)每日灌胃1 次。軟皮湯處理組：博來霉素PBS 溶液1 mg/mL 100 μL 每日同一位點注射1 次， 生藥量0.9g/mL 軟皮湯0.2 mL/10 g 灌胃，每日1 次。 連續處理4 周后，處死動物，收取注射區域皮膚。

1.5 Masson 染色

皮膚組織經多聚甲醛固定、 石蠟包埋后，5 μm連續切片。 染色前，石蠟切片經過脫蠟、水化處理。本實驗按照Masson 染色試劑盒的方法開展：（1）細胞核染液染色2 min，倒掉細胞核染色液，沖水30 s；（2）胞漿染液染色40 s，倒掉胞漿染色液，沖水30 s；（3）分色液分色8 min；（4）藍色復染液染色3 min， 倒掉復染液， 無水乙醇沖洗干凈；（5）吹干后用無毒環保封固劑封片、鏡檢。

1.6 蛋白提取

稱取約100 mg 的組織物， 記下質量， 加入700 μL 4 ℃預冷PBS，剪碎。 點動離心，重復3～4次， 倒去PBS。 加入RIPA 300 μL/100 mg 組織，vortex 震蕩。勻漿機勻漿5～8 min。設置聲儀：超聲強度37%，0.8 s/次。超聲12～15 次。16 000 g，4 ℃，離心30 min。 離心結束后取中間層液體-80 ℃冰箱保存備用。

1.7 檢測方法

Western Blot 蛋白定量后， 經聚丙烯酰胺凝膠電泳，并轉膜。 5%脫脂牛奶封閉后，一抗4 ℃孵育過夜。 用TBST 洗膜2 次，每次7 min。 HRP 標記二抗室溫下孵育1～2 h，用TBST 洗3 次，每次7 min。進行化學發光顯影。 用Image J 分析目標條帶的光密度值。 以β-Actin 為內參照， 比較CollagenⅠ、FLI1、Fibronectin、SAMD3 蛋白表達的差異。CollagenⅠ、FLI1、Fibronectin、SAMD3 的相對蛋白表達量=各個蛋白的光密度值/β-Actin 光密度值。p-SMAD3 相對表達量=各組樣本p-SMAD3 光密度值/ SAMD3光密度值。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 Masson 三色染色觀察硬皮病小鼠皮膚纖維化程度

經過Masson 三色染色病理切片，正常組纖維層染色最淺，軟皮湯組稍高；模型組染色最深，顯示其組織的纖維化明顯。 由此可見，硬皮病小鼠經過軟皮湯干預后，病變皮膚纖維化程度減輕，趨向正常水平。 如圖1 所示（見封三彩圖）。

2.2 各組小鼠皮膚組織CollagenⅠ和Fibronectin 蛋白表達水平的比較

小鼠皮膚CollagenⅠ和Fibronectin 的蛋白表達水平，在模型對照組均高于正常對照組和軟皮湯組（P＜0.05）。 表明軟皮湯可不同程度抑制模型小鼠皮膚中膠原相關因子CollagenⅠ、Fibronectin 的表達。見表1。

表1 各組小鼠皮膚組織CollagenⅠ和Fibronectin 表達（±s）

表1 各組小鼠皮膚組織CollagenⅠ和Fibronectin 表達（±s）

注：與正常對照組比較*P＜0.05；與模型對照組比較#P＜0.05。 下表同。

組 別正常對照組模型對照組軟皮湯組n 10 10 10 Collagen Ⅰ1.00±0.05 3.52±0.16*1.22±0.05*#Fibronectin 1.00±0.04 2.58±0.14*1.31±0.07*#

2.3 各組小鼠皮膚組織中FLI1、SMAD3、p-SMAD3蛋白表達水平比較

SMAD3 在各組中的蛋白表達水平無明顯差異；FLI1 的表達水平在模型對照組中均低于正常對照組和軟皮湯組。p-SMAD3 在模型對照組中的表達水平均明顯高于正常對照組和軟皮湯組（P＜0.05）。 結果顯示， 在硬皮病小鼠皮膚模型中，TGF-β 途徑的p-SMAD3/FLI1 因子表達比值增大， 而經過軟皮湯干預后，該比值有一定程度下降，雖與正常組仍有一定差距，但已趨向正常水平。 見表2。

表2 各組小鼠皮膚組織FLI1、p-SMAD3、SMAD3 的表達（±s）

表2 各組小鼠皮膚組織FLI1、p-SMAD3、SMAD3 的表達（±s）

組 別正常對照組模型對照組軟皮湯組n 10 10 10 FLI1 1.00±0.04 0.33±0.02*0.92±0.05 p-SMAD3 1.00±0.03 4.62±0.23*1.53±0.08*#SMD3 1.00±0.03 0.98±0.05 1.02±0.05

3 討論

硬皮病是復雜的自身免疫性疾病，臨床辨病呈現病譜性變化，病譜一端為局限性硬皮病，另一端為彌漫型系統性硬皮病，兩者之間包括CREST 綜合征、Sine 硬皮病、嗜酸性筋膜炎等。 中醫辨證分型主要分為肺脾虧虛型與脾腎虧損型。 雖存異質性變化，然其核心病理均不同程度在于：血管損傷、自身免疫、皮膚與內臟器官纖維化。 優良的動物模型是硬皮病研究的重要工具， 相對硬皮病細胞模型，硬皮病小鼠能更好地模擬疾病的體內復雜微環境以及核心病理變化。 本研究使用博萊霉素局部注射構建硬皮病小鼠模型[6]，可在機體內產生活性氧，誘導自身免疫反應，刺激成纖維細胞合成膠原。 在注射博萊霉素后， 小鼠逐漸出現局部皮膚萎縮變硬、毛發脫落、活動減少、食量下降、發育延緩、體質量減輕等表現。 由此可見，該疾病模型體現了硬皮病的主要癥狀，且一定程度地模擬了臨床硬皮病患者的肺脾腎虛損之證。

針對硬皮病肺脾腎虛損，依“損者益之，虛者補之”補益原則，鄧鐵濤教授主張硬皮病治療宜肺脾腎同治、補腎益精為法[1]。 據此，擬定治療硬皮病的補腎益精法軟皮湯：熟地黃補腎為君；黃芪、淮山藥、阿膠補脾肺，養陰血，引藥直達肌表之功為臣；山茱萸、茯苓加強補益脾腎之效為佐；紅花為使，使諸藥補而不滯；全方共奏健脾養肺、補腎益精之效。在臨證中，軟皮湯中藥復方能不同程度改善患者纖維化癥狀[1-2]。 前期實驗提示，軟皮湯體外作用靶向于TGF-β 通路，與SMAD3、FLI1 平衡變化相關[5，7]。據此，本課題組提出SMAD3/FLI1“平衡”的概念。 研究顯示，硬皮病小鼠SMAD3、FLI1 因子失衡，軟皮湯中藥復方可使硬皮病小鼠TGF-β 通路中活化因子SMAD3 與抑制因子FLI1 再平衡，皮膚纖維化程度減輕，Ⅰ型膠原蛋白、纖維連接蛋白分泌減少。

SMAD3、FLI1 同屬保守的轉錄因子網絡，可相互結合成組織限制性異二聚體， 參與細胞增殖與組織特異性分化[8]。 在纖維化過程中， 二者均處于TGFβ 通路下游，效應部位位于細胞核內。 當TGF-β 通路靜息時，FLI1 與膠原蛋白啟動子結合， 抑制膠原蛋白轉錄；當TGF-β 通路活化時，SMAD3 競爭FLI1的啟動子結合位點，促進膠原蛋白轉錄[9-10]。 本研究顯示，軟皮湯組、模型對照組與正常對照組活化因子SMAD3 表達量并無統計學差異， 而三組間主要差異在于磷酸化的SMAD3 因子（p-SMAD3）；軟皮湯使硬皮病小鼠p-SMAD3 減少， 趨向正常對照組水平，而對SMAD3 量無明顯影響；提示中藥復方對活化因子SMAD3 的調節可能與磷酸化有關。與國外研究一致， 磷酸化的SMAD3 因子才是TGF-β 通路活化的標志；未磷酸化的SMAD3 位于胞漿內；僅當TGF-β 通路活化，SMAD3 被TGF-βⅠ型受體磷酸化，與協同性SMADs 形成復合物后進入核內，激活膠原相關基因轉錄[11]。 同時，軟皮湯中藥復方增加了硬皮病小鼠體內的抑制因子FLI1 表達，使其趨向正常水平， 可能增強了對膠原蛋白基因轉錄的抑制[9]。然而，中藥復方通過何種途徑影響了抑制因子FLI1的表達，其機制仍不明確，需要更進一步研究。

[1]鄧鐵濤.肺脾腎相關辨治硬皮病[J].中國中醫藥現代遠程教育，2004，2(6)：15-16.

[2]鄭 洪.鄧鐵濤教授治療硬皮病驗案2 則[J].新中醫，2002，34(5)：10.

[3]Varga J，Pasche B.Transforming growth factor beta as a therapeutic target in systemic sclerosis [J]. Nat Rev Rheumatol，2009，5(4)：200-206.

[4]齊 慶，李東海，查旭山，等.補腎益精法對硬皮病成纖維細胞表型的影響及其表觀遺傳學意義[J].新中醫，2011，43(2)：134-136.

[5]齊 慶，毛越蘋，易娟娟，等.補腎益精法對硬皮病成纖維細胞SMAD3/FLI1 平衡的影響[J].四川中醫，2012，30(6)：43-45.

[6]Yamamoto T， Takagawa S， Katayama I， et al. Animal model of sclerotic skin. I： Local injections of bleomycin induce sclerotic skin mimicking scleroderma [J]. J Invest Dermatol，1999，112(4)：456-462.

[7]齊 慶，毛越蘋，易娟娟，等.補腎益精法中藥復方對硬皮病小鼠皮膚纖維化的影響[J].新中醫，2012，44(6)：149-150.

[8]Ravasi T， Suzuki H， Cannistraci CV， et al. An atlas of combinatorial transcriptional regulation in mouse and man [J]. Cell，2010，140(5)：744-752.

[9]Asano Y，Bujor AM，Trojanowska M. The impact of Fli1 deficiency on the pathogenesis of systemic sclerosis [J]. J Dermatol Sci，2010，59(3)：153-162.

[10]Trojanowska M. Noncanonical transforming growth factor beta signaling in scleroderma fibrosis [J]. Curr Opin Rheumatol，2009，21(6)：623-629.

[11]Seuntjens E， Umans L， Zwijsen A， et al. Transforming Growth Factor type beta and Smad family signaling in stem cell function [J]. Cytokine Growth Factor Rev，2009，20 (5-6)：449-458.

圖1 各組大鼠回盲部腸黏膜切片電鏡觀察圖（HE，×400）