LAMP熒光染色法檢測人乳頭瘤病毒的臨床應用

羅永富，龔宗躍

（湖南中醫藥高等專科學校，湖南 株洲 412012）

人乳頭瘤病毒（Human Papilloma Virus，HPV）是引起尖銳濕疣的主要病原體，目前還不能進行體外細胞培養，且其抗原接觸免疫系統的機會少，難以用檢測抗體的方法診斷。PCR（聚合酶鏈式反應）檢測病毒DNA序列具有特異和敏感等特點，但需要特殊的儀器設備，且對檢測人員有較高的技術要求，難以用于基層。本研究采用環介導等溫擴增技術（LAMP）結合熒光染色檢測HPV，對尖銳濕疣的預防、早期快速診斷和治療具有特別重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標本 所有臨床標本均取自株洲市二醫院皮膚科2011年5月至2012年8月期間的門診患者，共76例。男性54例，其中20～30歲患者28例，30～40歲患者19例，40～50歲患者7例；女性患者22例，其中20～30歲患者15例，30～40歲患者6例，40～50歲患者1例。標本均由門診醫生采集，用棉拭子在患者外陰部疑似病灶部位涂抹，置于裝有1mL無菌生理鹽水的試管中送檢。

1.1.2 試劑 針對HPV-6 E6基因（基因序號：AF092932）的174～381 bp序列和HPV-11 E6基因（基因序號：M14119）的129～306 bp區域序列，利用專用引物軟件（Primer Explorer V4）分別設計兩型HPV的4條LAMP引物，引物由廣州英駿公司合成并分別配制成HPV-6引物液和HPV-11引物液；100 bp DNA Ladder（BioDev公司）；限制性內切酶（Pro mega公司）；Taq plus DNA聚合酶（北京鼎國公司）；Betaine（Fluka公司）；Bst DNA Polymerase（Biolabs公司）；DNA Maker I（天根公司）；dNTP（北京鼎國公司）；一管式病毒DNA提取試劑盒（四川天澤公司）；MgSO4（Sigama公司）；SYBR Green I（北京天恩澤基因科技有限公司）。其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 標本處理與核酸提取液制備 送檢標本充分振蕩懸浮，擠干棉拭子中的水分，棄棉拭子，15000 r/min離心5分鐘，棄上清液，留沉淀，加600μL病毒DNA提取液充分混勻，加700μL異丙醇，振蕩混勻，12000 r/min離心1分鐘，棄上清液，沉淀用75%乙醇洗滌2次，12000 r/min離心1分鐘，棄上清液，將離心管倒置于濾紙上10～15分鐘，待酒精揮發完后加入100μLTE溶液，4℃過夜充分溶解DNA，-20℃保存備用。沙眼衣原體陽性標本同樣處理，作為陰性對照備用。

1.2.2 LAMP取反應杯4只，1號和2號為待測杯，3號和4號為沙眼衣原體陽性標本核酸提取液的陰性對照杯。具體方法見表1。

表1 環介導等溫擴增（LAMP）

混勻，置于65℃孵育擴增60分鐘，然后置于80℃2分鐘滅活酶，終止擴增。

1.2.3 染色與結果觀察 每只反應杯中加入熒光染料SYBR Green I 1.0μL，混勻，置于紫外燈下觀察結果。反應混合物變綠為陽性；保持SYBR Green I的橙色不變為陰性[1]。

實驗數據采用SPSS13.0軟件進行統計學分析。

2 結果

陰性對照標本為陰性。LAMP檢測76例臨床標本發現，23例為HPV-6陽性，18例為HPV-11陽性，合計41例陽性，總檢出率為53.95%。PCR檢測結果發現，25例為HPV-6陽性，15例為HPV-11陽性，合計40例陽性，總檢出率為52.63%。在LAMP檢測為陽性的標本中，有6例PCR檢測為陰性，而PCR檢測為陽性的標本中，有5例LAMP檢測為陰性。各臨床病例標本檢測結果統計見表2。

表2 76例臨床標本檢測結果統計（例）

經方差分析：χ2=0，P>0.05，LAMP與PCR的檢出率無顯著性差異。

3 討論

（1）環介導等溫擴增技術[2]針對靶基因6個區域設計4條特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA Polymerase）在恒溫條件下完成擴增，擴增效果可用凝膠電泳、比濁、染色等多種方法檢測，具有反應時間短、肉眼可判斷結果和不需要PCR儀等優點。眾多學者嘗試利用該技術對多種病原體進行檢測的方法研究，取得了令人滿意的結果[3-6]。本報導是在實驗室基礎研究的基礎上進行的臨床實際應用并與PCR方法比對的研究。

（2）人乳頭瘤病毒6型和11型引起的傳染性疾病是一個嚴重的公共衛生問題，也被認為是人類生殖器癌潛在的主要致病因素[7-10]。探索適應基層醫療單位特異、快速、敏感及簡便的臨床人乳頭瘤病毒檢測方法具有重要的社會價值和理論意義。本研究為LAMP的臨床應用做了有益的探索。

（3）統計結果表明，LAMP與PCR的陽性檢出率無顯著性差異（χ2=0，P>0.05），說明LAMP完全可以替代PCR，可作為基層醫療單位臨床實驗室常規檢測方法推廣應用。

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