桔小實蠅卵巢形態結構及發育特征研究

陳 敏，陳 鵬，葉 輝，季清娥，黎劍平

(1.云南大學跨境生態與生態安全實驗室，昆明 650091;2.云南省林業科學院，昆明 650201;3.西南林業大學生命科學學院，昆明 650224;4.福建農林大學植物保護學院，福州 350002;5.西南林業大學林學院，昆明 650224)

桔小實蠅Bactrocera dorsalis (Hendel)，隸屬雙翅目 Diptera、實蠅科 Tephritidae、果實蠅屬Bactrocera。桔小實蠅寄主廣泛，可危害40 余科植物的300 余種瓜果;繁殖能力強，每雌產卵最高可達上千枚;危害嚴重，可取食芒果、柑桔等具有重要經濟價值的熱帶亞熱帶瓜果，在防控不當情況下可導致大量減產，造成重大經濟損失(Smith，1989;李紅旭和葉輝，2000;Clarke et al.，2005;黃素青和韓日疇，2005)。一直以來，桔小實蠅被世界各國作為主要瓜果害蟲或列為重要檢疫蟲害(張潤杰和侯柏華，2005)

桔小實蠅繁殖生物學是開展桔小實蠅監測防控的知識基礎，是闡釋桔小實蠅繁殖行為的主要依據。桔小實蠅雌成蟲行為及相關繁殖活動受卵巢發育進度調控，在卵巢發育成熟前主要表現為搜尋食物和補充營養，卵巢成熟后轉入搜尋繁殖寄主，進行產卵繁殖(Siderhurst and Jang，2006;2010)。卵巢發育狀況決定了桔小實蠅以取食為主抑或產卵為主的行為特征(Avarre et al.，2007)。

實蠅類昆蟲的卵巢發育進度可以通過卵巢的形態結構特征加以反映，卵巢形態特征也由此被作為直觀判別卵巢發育進度的客觀依據(Kendra et al.，2006)。作為桔小實蠅繁殖生物學研究的一部分，本研究將揭示桔小實蠅卵巢形態結構及其發育特征，闡釋桔小實蠅卵巢發育與其形態結構聯動變化的內在關聯，并從桔小實蠅預測監控出發，探索對桔小實蠅卵巢發育進程加以特征分級。本研究將為認識桔小實蠅卵巢形態結構及其發育特征提供了新的知識，為利用桔小實蠅卵巢特征開展桔小實蠅高效監測預報防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

本研究在云南大學跨境生態與生態安全實驗室進行。供試桔小實蠅源于福建農林大學益蟲研究所，在本實驗室已經兩代繁殖。

1.2 試蟲飼養

飼養桔小實蠅的培養箱為LRH-250-GS(廣東省醫療器械廠和廣東省環保儀器廠合作生產)，實驗條件設置為26℃溫度，L ∶D=12 h∶12 h光照時間，60%相對濕度。供試用桔小實蠅雌成蟲均為同日羽化，放入培養箱中養蟲籠(35 cm× 30 cm× 30 cm)內，飼以糖水(1 ∶3)和酵母液(1 ∶3)。糖水和酵母液浸于棉球中，置于養蟲籠中培養皿內，每隔12 小時更換一次。桔小實蠅產卵期間，在養蟲籠放置帶皮香蕉供桔小實蠅產卵。

1.3 卵巢觀察

從雌性成蟲羽化之日起，逐日取雌成蟲20 頭進行卵巢解剖，觀察記錄卵巢形態特征及發育進度。卵巢解剖在體視顯微鏡(PXS-2040)下進行。卵巢解剖步驟是，先在潔凈載玻片凹處滴一滴Ringer's 生理鹽水，用解剖剪取下桔小實蠅腹部置載玻片凹處，用解剖針去除腹部背板和腹板，用鑷子取出桔小實蠅卵巢，剔除卵巢周圍的脂肪等，用Ringer's 生理鹽水清洗卵巢1-2 次。利用AUTO-MO1VFAGE 景深共聚焦重構分析系統獲取卵巢形態特征照片，記錄卵巢長寬、卵巢小管長寬和數量、卵粒長寬和數目等相關參數。

2 結果與分析

2.1 桔小實蠅雌性生殖系統結構

桔小實蠅的雌性生殖器官主要由卵巢、輸卵管及附腺和受精囊等組成(圖1)。卵巢有兩組，每組卵巢包裹于透明卵巢膜內，整體上形似橢圓狀，羽化初期為淡黃色，后期呈乳白色。每組卵巢含28個卵巢管。在發育成熟的卵巢管中，其端部可見無色的卵原細胞，及經過分裂后產生的卵母細胞和營養細胞，在卵巢管基部常見一枚成熟卵。卵巢基部與側輸卵管相接，兩側輸卵管再與中輸卵管匯合(圖1)。受精囊呈圓球狀，通過細長的受精囊管與中輸卵管連結(圖1)。雌性生殖器官含附腺1 對，為無色透明囊狀，基部與中輸卵管相連(圖1)。

2.2 卵巢發育特征

逐日觀察發現，卵巢在雌成蟲羽化第1 d 較小，呈淡黃色球狀，隨時間推移逐漸增大，至第7 d增大明顯，呈乳白色橢圓狀，羽化第10 d 左右卵巢體積達到最大，約為1.78 mm×1.50 mm。進入產卵末期，卵巢開始逐漸變小，最小時約為0.94 mm×0.85 mm。

圖1 桔小實蠅雌性生殖器官示意Fig.1 Ovaries of Bactrocera dorsalis female

新羽化雌成蟲卵巢內似絮狀物，無卵巢管，第4 d 后可見少量卵巢管，呈乳白色。卵巢管分化發育從兩組卵巢相向一側開始，隨時間推移卵巢管逐漸增多，在羽化后第10 d 卵巢內各卵巢管全部發育成熟，每組卵巢內卵巢管數量為28 根。

隨卵巢發育進程，各卵巢管也逐漸增長，成熟卵巢管長度約為1.50 mm，直徑約為0.20 mm。進入產卵末期，卵巢管數量逐漸減少，長度逐漸縮短。在產卵末期，卵巢管漸次消解，卵巢相應萎縮。

雌成蟲羽化后第4 d，先期形成的卵巢管內可見卵粒，其呈乳白色。觀察發現，卵的發育與卵巢管的發育大體同步，卵母細胞和漸成熟卵粒隨卵巢管發育而逐漸顯現。卵巢管發育成熟后，其內均具有一枚發育近成熟的卵。觀察還發現，后期形成的卵巢管較先期形成的卵巢管在發育進程上要快得多。羽化第10 d 后，各卵巢管內均可見1枚近成熟卵和2-3 枚待成熟卵，卵巢內總計可有56 枚近成熟卵。卵巢管內卵粒大小為1.05 mm×0.20 mm。桔小實蠅開始產卵時，卵巢內所有卵巢管均基本發育成熟。

2.3 卵巢分級

卵巢分級是根據卵巢發育進度基于卵巢形態特征對卵巢發育進行的一種劃分方式，以便掌握和辨識卵巢發育進度，并根據卵巢發育進度開展相關科學研究和實蠅種群預測 (李汝鐸等，1987)。根據桔小實蠅卵巢發育過程中卵巢的形狀、大小、顏色、卵巢小管的形成、卵粒的有無等特征，本研究將卵巢發育階段分為5 級，即發育初期(Ⅰ級)、卵黃沉積期(Ⅱ級)、成熟待產期(Ⅲ級)、產卵盛期(Ⅳ級)和產卵末期(Ⅴ級)。

Ⅰ級定為卵巢發育初期，主要特征是卵巢體積大小為0.53 mm×0.51 mm 左右，卵巢內呈乳白色絮狀，卵巢表面附著大量白色端絲。卵巢管未分化。

Ⅱ級為卵黃沉積期，在該時期卵巢體積明顯增大，略為1.26 mm×1.11mm 左右，呈淡黃色半透明狀。卵巢管開始分化，每組卵巢內可見4-6根卵巢管，其呈淡黃色或轉為乳白色，長度約1.24 mm 。卵巢內可見4-6 枚乳白色近成熟卵粒。

Ⅲ級為成熟待產期，識別特征是卵巢體積達到最大，為1.78 mm×1.50 mm 左右，呈乳白色橢圓球狀;卵室內充滿乳白色近成熟卵粒，排列整齊。

Ⅳ級為產卵盛期，主要表現為卵巢體積較小，大小1.46 mm×1.04 mm 左右，呈乳白色橢球狀;卵巢內可見8-10 粒乳白色成熟卵粒。

Ⅴ級為產卵末期，主要特征是卵巢體積小，大小0.94 mm×0.85 mm 左右，呈淡黃色球狀;卵巢表面附著大量白色端絲;卵巢管消失;卵巢內已無白色卵粒。

3 結論與討論

卵巢是實蠅產卵繁殖的重要器官，本研究結果表明:桔小實蠅卵巢由兩組卵巢管組成，每組卵巢含卵巢管28 根。新羽化桔小實蠅卵巢處于發育初期，無卵巢管。羽化后第4 d，卵巢管開始顯現，卵巢管數量增加，至第10 d 左右，卵巢發育成熟。進入產卵末期，卵巢管逐漸消解，卵巢變小萎縮。桔小實蠅卵巢發育進程分為5個發育等級，即發育初期(Ⅰ級)、卵黃沉積期(Ⅱ級)、成熟待產期(Ⅲ級)、產卵盛期(Ⅳ級)和產卵末期(Ⅴ級)。

在實蠅的繁殖生物學研究中，卵巢管的結構及數量與實蠅的繁殖行為及繁殖力密切關聯(Wayne et al.，1997)。桔小實蠅繁殖能力強、產卵量大，每雌平均產卵1200-1500 枚，最高可產卵1800 枚 (Ye，2001;謝琦和張潤杰，2005)。本研究揭示，桔小實蠅卵巢分為兩組，每組卵巢含卵巢管28個(圖1)。在桔小實蠅性發育成熟期，同一卵巢管內可見有1 枚成熟及2-3 枚待成熟卵。從卵巢管結構和數量推論，桔小實蠅在正常情況下可一次性產卵56 枚以上，一生產卵至少可達224 枚。如果桔小實蠅每雌可產卵1000 余枚，則每卵巢管平均可孕育近20 枚卵。新羽化桔小實蠅需取食發育直到性成熟后才開始產卵繁殖(Siderhurst and Jang，2010)。本研究基于卵巢器官解剖觀察發現，新羽化桔小實蠅卵巢僅為一雛形，需10 d 左右才發育成熟。在此期間，卵巢發育經歷了卵巢管形成、卵母細胞和營養細胞發育、卵形成發育和成熟等過程。此外，隨桔小實蠅產卵結束，卵巢管將隨之消解，卵巢也逐漸萎縮(圖2)。本研究從組織發生學上，闡釋了桔小實蠅卵巢生長發育的主要特征和基本規律，揭示了新羽化桔小實蠅在產卵前期表現出積極食物搜尋行為的內在原因(圖2)。

圖2 桔小實蠅卵巢發育分級圖Fig.2 Stages of ovarian development in Bactrocera dorsalis female

桔小實蠅卵巢管分化及發育進度因其所在卵巢中的位置而異。同時，在卵巢管的形成過程中，卵的發育也隨之進行(圖2)。該現象在其它昆蟲中也有發現(葉輝，1996)。研究還發現，分化晚的卵巢管在發育進度上較分化早的要快，同時，盡管先期分化發育的卵巢管及所孕育的卵看似已經發育成熟，但桔小實蠅仍僅在所有卵巢管發育成熟后才開始產卵。桔小實蠅卵巢及卵發育的這一特征在過去文獻報道中尚不多見，它解釋了桔小實蠅集團產卵的物質基礎(袁盛勇等，2003)，但其適應性進化的邏輯基礎及內在的調控機制仍不清楚。

實蠅性成熟進度因溫度不同而表現出明顯差異(Liu and Ye，2009;余麗萍和徐南昌，2012)。番石榴實蠅產卵前期在24℃溫度下為38.75 d，在30℃溫度下為23.25 d，在33℃溫度下為20.50 d(Liu and Ye，2009)。瓜實蠅在20℃溫度產卵前期下為36.43 d，在25℃溫度下為23.06 d，在30℃溫度下則為15.90 d (韋淑丹等，2011)。桔小實蠅在12℃溫度產卵前期為48 d，在22℃溫度產卵前期為18d，在28℃溫度下為10 d (余麗萍和徐南昌，2012)。本研究中，桔小實蠅在26℃溫度下的產卵前期為10 d。上述說明，隨環境溫度變化，桔小實蠅卵巢發育進度將隨之發生相應改變。

實蠅性成熟期還與其所獲得的營養有關。蛋白質是影響實蠅生殖系統發育的重要營養源，糖是維持生命基本活動的重要營養源 (王波等，2012)。Carey et al.(1998)認為，實蠅取食蛋白更容易釋放荷爾蒙有助于提高交配成功率，當實蠅由取食糖向取食蛋白轉變時，其行為則由覓食為主轉到以產卵為主。王波等(2012)報道，桔小實蠅在僅飼以糖的情況下，性發育受阻，不能正常產卵。在本實驗26℃溫度下飼以糖水和酵母液，新羽化桔小實蠅經10 d 可達到性成熟。

本研究基于卵巢形態學特征對桔小實蠅卵巢發育進度進行了分級，旨在從卵巢形態特征上反映卵巢的發育進度，為桔小實蠅科學防控提供依據。通常類似的分級往往分為4 級(Chou et al.，2012)。本研究觀察表明，桔小實蠅在產卵結束之后仍能存活一段時間，其卵巢顯著萎縮，故將其列為第5 級，以便完整反映卵巢從最初形成到最終萎縮的全過程。

References)

Avarre JC，Lubzens E，Babin PJ.Apolipocrustacein，formerly vitellogenin，is the major egg yolk precursor protein in decapod crustaceans and is homologous to insect apolipophorin II/I and vertebrate apolipoprotein B.［J］.BMC Evolutionary Biology，2007，7 (1):3.

Carey JR，Liedo P，Müller HG，et al.Dual modes of aging in mediterranean fruit fly females ［J］.Science，1998，281 (5379):996-998.

Chou MY，Mau RFL，Jang EB，et al.Morphological features of the ovaries during oogenesis of the oriental fruit fly，Bactrocera dorsalis，in relation to the physiological state ［J］.Journal of Insect Science，2012，12 (144):1-12.

Clarke AR，Armstrong KE，Carmichael AE，et al.Invasive phytophagous pests arising through a recent tropical evolutionary radiation:The Bactrocera dorsalis complex of fruit flies ［J］.Annual Review of Entomology，2005，50:293-319.

Huang SQ，Han RC.Advance in the research on the quarantine pest Bactrocera dorsalis ［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2005，42(5):479-484.［黃素青，韓日疇.桔小實蠅的研究進展［J］.昆蟲知識，2005，42 (5):479-484］

Li HX，Ye H，Lu J.On damages and distributions of fruit fly(Bactrocera dorsalis Hendel)in Yunnan Province，Southern China［J］.Journal of Yunnan University (Natural Sciences Edition)，2000，22 (6):473-475.［李紅旭，葉輝.桔小實蠅在云南的危害與分布［J］.云南大學學報，2000，22 (6):473-475］

Liu XF，Ye H.Effect of temperature on development and survival of Bactrocera correcta (Diptera:Tephritidae)［J］.Scientific Research and Essay，2009，4 (5):467-472.

Siderhurst MS，Jang EB.Cucumber volatile blend attractive to female melon fly，Bactrocera cucurbitae (Coquillett)［J］.Journal of Chemical Ecology，2010，36:699-708.

Smith PH.Behavioral partitioning of the day and circadian rhythmicity.In:Robinson AS，Hooper G，eds.Fruit Flies:Their Biology，Natural Enemies and Control.World Crop Pests Series Vo1.3B.Amsterdam:Elsevier.1989.325-341.

Wang B，Ji QE，Chen JH，Han Y，et al.The fecundity and life table of experimental population of B.dorsalis under different nutrition condition ［J］.Chinese Journal of Tropical Crops，2012，33 (3):551-555.［王波，季清娥，陳家驊，等.不同營養條件對桔小實蠅實驗種群生殖力及生命表的影響［J］.熱帶作物學報，2012，33 (3):551-555］

Wayne ML，Hackett JB，Mackay TFC.Ouantitative genetics of ovarioIe number in Drosophila melanogaster I .Segregating variation and fitness ［J］.Euolution，1997，51:1156-1163.

Wei SD，Huang SS，Wang YQ，et al.Effect of temperature on the development and reproduction of Bactrocera cucurbitae (Coquillett)population ［J］.Guangxi Agricultural Sciences，2011，42 (7):744-747.［韋淑丹，黃樹生，王玉群，等.溫度對瓜實蠅實驗種群生長發育及生殖的影響研究［J］.南方農業學報，2011，42 (7):744-747］

Xie Q，Zhang RJ.Study advance on biology and ecology of Bactrocera dorsalis (Hendel)and its control ［J］.Ecological Science，2005，24 (1):52-56.［謝琦，張潤杰.桔小實蠅生物學特點及其防治研究概述［J］.生態科學，2005，24 (1):52-56］

Yu LP，Xu NC.Relationship with the biological characteristics of Bactrocera dorsalis and temperature ［J］.China Garden Digest，2012，(5):19-21.［余麗萍，徐南昌.柑桔小實蠅生物學特性與溫度的關系［J］.中國園藝文摘，2012，(5):19-21］

Yuan SY，Xiao C，Kong Q，et al.Oviposition prefernce of Bactrocera dorsalis Hendel ［J］.Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis(Natural Sciences Edition)，2005，27 (1):81-84.［袁盛勇，肖春，孔瓊，等.桔小實蠅的產卵選擇性［J］.江西農業大學學報，2005，27 (1):81-84］

Yuan SY，Xiao C，Li ZQ，et al.A Study on laboratory rearing techniques for Bactrocera dorsalis (Hendal)［J］.Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis (Natural Sciences Edition)，2003，25(4):577-580.［袁盛勇，肖春，李正躍，等.桔小實蠅實驗室飼養技術研究［J］.江西農業大學學報(自然科學版)，2003，25 (4):577-580］

Ye H.Distribution of the oriental fruit fly (Diptera:Tephritidae)in Yunnan Province ［J］.Entmol.Sin.，2001，8 (2):175-182.

Ye H.Studies on the biology of Tomicus piniperda L.(Coleoptera:Scolytidae)in the shoot feeding period ［J］.Acta Entomologica Sinica，1996，39 (1):58-62.［葉輝.縱坑切梢小蠹蛀梢期生物學研究［J］.昆蟲學報，1996，39 (1):58-62］

Zhang RJ，Hou BH.Assessment on the introduction risk of Bactrocera dorsalis (Hendel)through imported fruits with fuzzy mathematics［J］.Acta Entomologica Sinica，2005，48 (2):221-226.［張潤杰，侯柏華.桔小實蠅傳入風險的模糊綜合評估［J］.昆蟲學報，2005，48 (2):221-226］