髓母細胞瘤與室管膜瘤腦脊液差異凝膠電泳方法的建立

李文臣，崔佳樂，李 日，羅毅男，洪新雨＊

（1.吉林大學第一醫院 神經外科，吉林 長春130021；2.吉林大學白求恩醫學院 組織學與胚胎學教研室，吉林 長春130021；3.吉林大學公共衛生學院 流行病與衛生統計學教研室，吉林 長春130021）

髓母細胞瘤和室管膜瘤都屬于惡性神經上皮腫瘤，由于它們是四腦室內最為常見的腫瘤，與腦干關系密切，手術不易徹底切除，且有沿腦脊液循環途徑種植轉移的傾向，導致它們治愈率低、預后差。腦脊液因與此兩種腫瘤的接近性和臨床可行性而具有重要的臨床診斷價值。腦脊液蛋白質組學能大規模、高通量地分析腦脊液蛋白質組成。雙向差異凝膠電泳（2D－DIGE）作為蛋白質組學重要的蛋白分離技術，能顯著提高蛋白檢測的靈敏度，并因其引入內標概念，更有利于對差異表達蛋白質的準確檢測。本實驗采用2D－DIGE技術建立髓母細胞瘤、室管膜瘤與正常對照三者腦脊液蛋白質圖譜，為進一步在髓母細胞瘤與室管膜瘤腦脊液中標志蛋白探尋研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 腦脊液標本 髓母細胞瘤與室管膜瘤腦脊液樣品來自于吉林大學第一醫院神經外科住院患者，并經術后病理確實。術前腰穿獲得髓母細胞瘤腦脊液樣品3例，術前核磁掃描顯示腫瘤皆位于后顱窩中線位置，突入四腦室內；術前腰穿獲得室管膜瘤腦脊液樣品3例，術前核磁掃描腫瘤全部位于四腦室內。正常對照組3例為吉林大學第一醫院神經內科門診頭痛患者的腦脊液（排除了其他神經系統器質性疾病、腦脊液常規生化檢查結果未見異常）。術前腰穿于第4、5腰椎間隙進行，每例樣品采集腦脊液標本約10ml；在4℃，10 000×g離心10min以去除腦脊液中的細胞及其他不溶物質，－70℃凍存備用。

1.1.2 主要試劑和儀器 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰、十二烷基硫酸鈉（SDS）、3－（3－膽胺丙基）二甲氨基－1－丙磺酸（CHAPS）、四甲基乙二胺（TEMED）、碘乙酰胺、牛血清白蛋白（BSA）、兩性電解質（pH 3－10）、非線性固相pH 梯度（IPG，24cm，pH 3－10）干膠條均購自美國Bio－Rad公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、甘氨酸、二硫蘇糖醇（DTT）、尿素、硫脲、考馬斯亮藍G－250均購自美國Amresco公司；丙酮購自美國J.T.Baker公司；三氯乙酸（TCA）購自北京化工；DIGE染料（CyDye）試劑盒購自GE Healthcare公司；等電聚焦儀（Ettan IPGphorⅡ）與垂直電泳儀（Ettan DALT－six）均購自美國 Amersham 公司；多功能激光掃描成像系統（Typhoon 9410）和差異分析軟件 （DeCyde V5.0）均購自美國 GE Healthcare公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 TCA－丙酮沉淀蛋白，取出凍存于－70℃的腦脊液，4℃解凍，10 000×g離心10 min，3例髓母細胞瘤腦脊液等體積混合后定為髓母細胞瘤組（M）；3例室管膜瘤腦脊液等體積混合后定為室管膜瘤組（E）；3例正常腦脊液等體積混合后定為正常對照組（Con）；采用預冷的10%濃度的TCA－丙酮溶液與樣本溶液4∶1混合，輕微顛倒混勻后置于－20℃沉淀2h，然后放入4℃超速離心機中12 000×g離心30min。倒置棄上清，晾干5 min。加入適量裂解液（7mol／L尿素、2mol／L硫脲、4%CHAPS和30mmol／L Tris－HCl pH 8.5），輕吹溶解沉淀，并用50mmol／L NaOH調節至pH 8.5。

1.2.2 蛋白定量 應用Bradford法測定蛋白濃度，將標準牛血清白蛋白梯度稀釋后，分別加入考馬斯亮藍染劑，測定波長為595nm時的吸光度值（A595），建立標準蛋白濃度和A595值的標準曲線。相同的方法處理待測各組腦脊液樣品，計算出樣品蛋白濃度。

1.2.3 熒光標記 標記方法采用CyDye DIGE最小標記法標記蛋白。并引入“內標，反標”標記，內標組（Standard）由三組蛋白等量混合而成。反標即每組蛋白都被Cy3和Cy5標記過，以消除標記誤差。Standard、M、E、Con各組每次取50μg蛋白，按400 pmol染料／50μg蛋白進行標記（表1）。

表1 腦脊液樣品分組與標記

1.2.4 2D－DIGE ①第一向等電聚焦：將3塊膠的每份上樣液450μl分別加入相應等電聚焦膠槽中，將24cm長的IPG干膠條（pH3－10）膠面向下放入膠槽，并使膠面與樣品溶液充分接觸。確保膠面下無任何氣泡后，室溫放置10min后加入礦物油覆蓋，以防止干膠。然后將已準備好的等電聚焦槽放置于等電聚焦電泳儀上，進行水化與等電聚焦（注意避光）。50V水化12h，然后進行等電聚焦，電壓設置為100V1h，300V1h，600V1h，1 000V1h，線性升壓2h至3 000V，線性升壓2h至10 000V后維持電壓10 000V聚焦80000伏小時（Vh），500 V 12h。②第二向SDS－PAGE：等電聚焦電泳結束后，進行兩步平衡。IPG膠條在含有1%DTT的平衡液（6M 尿素，2%SDS，50mM Tris－HCL pH8.8和30%甘氨酸）Ⅰ及含有4%碘乙酰胺的平衡液Ⅱ中分別平衡15min。然后將IPG膠條轉移到12%的SDS－聚丙烯酰胺凝膠上端，使用0.5%瓊脂糖封頂，進行SDS－PAGE電泳，參數設置為12mA／gel，1.5h；20mA／gel，12h直至溴酚藍到達膠的底端。

1.2.5 凝膠圖像掃描分析 用Typhoon 9410激光掃描儀在熒光模式下，分別用488nm、532nm、633nm的激發波長分別對Cy2、Cy3和Cy5進行成像掃描。采用Decyder圖像分析軟件中的膠內差異分析DIA模塊和生物學差異分析BVA模塊對圖像結果進行分析。DIA模塊對2D－DIGE掃描圖像進行蛋白質點檢測和含量分析；不同組腦脊液蛋白點的確認、匹配和表達差異的比較均在BVA模塊中進行。蛋白表達量上調或下調2倍以上，P＜0.05的蛋白點定義為差異表達蛋白點，統計學處理采用t檢驗方法。

2 結果

根據實驗分組，共有3塊2D－DIGE膠，采用3種不同波長掃描后，每塊膠得到3幅熒光圖，共得到9幅熒光圖。不同熒光染料標記的樣品呈現不同顏色，Cy2標記的內標組腦脊液蛋白為藍色圖譜（圖1 A）；Cy3標記的腦脊液蛋白為綠色圖譜（圖1B）；Cy5標記的腦脊液蛋白為紅色圖譜（圖1C）。每塊膠的腦脊液蛋白圖譜清晰。

圖1 3號膠2D－DIGE圖

2D－DIGE圖像蛋白點識別和定量分析結果表明，膠1、膠2和膠3分別檢測到1552、1547和1566個蛋白質點。生物學差異分析結果表明，表達量變化超過兩倍的差異蛋白質點，在髓母細胞瘤組與正常對照組中有36個，其中上調的有17個，下調的有19個；室管膜瘤組與正常對照組中有71個，其中上調的有35個，下調的有36個；而髓母細胞瘤組與室管膜瘤組中有52個，其中上調的有13個，下調的有39個。僅在髓母細胞瘤中上調的蛋白質點有8個，而僅在室管膜組中上調的蛋白質點10個。

3 討論

髓母細胞瘤與室管膜瘤都為惡性神經上皮腫瘤，髓母細胞瘤較室管膜瘤惡性程度更高，術前不易區分。絕大多數髓母細胞瘤與室管膜瘤都位于腦室系統內，與腦脊液直接接觸，并且腫瘤細胞易脫落隨腦脊液播散轉移，所以腫瘤細胞破裂滲出的內容物或腫瘤細胞分泌的物質，都容易出現在腦脊液中。并且臨床上獲取腦脊液較為容易，創傷較小。因此，腦脊液是探尋髓母細胞瘤與室管膜瘤標志蛋白的獨特窗口。而蛋白組學技術的快速發展，為在腦脊液中尋找腫瘤標志蛋白提供了巨大技術支持。

雙向凝膠電泳是經典的、被廣泛應用的蛋白質分離技術[1]。而近年來2D－DIGE技術，能更加提高雙向凝膠電泳對蛋白的檢測靈敏度，有利于對腦脊液蛋白質差異表達的準確檢測[2]。由于正常腦脊液中所含蛋白量較低約0.05－0.45mg／ml，而傳統的雙向凝膠電泳需要較多的上樣蛋白進行后續蛋白含量變化分析，而要求大量腦脊液樣品蛋白[3]，而2DDIGE熒光標記靈敏度高，上樣量少，僅需50μg。2D－DIGE是將待比較的等量樣本蛋白質預先經熒光染料（Cy2、Cy3和Cy5）標記后，等量混合在同一塊膠上進行雙向凝膠電泳分離，之后分別用波長為488nm、532nm、633nm的激光掃描獲取圖像，軟件分析蛋白表達差異[4]。2D－DIGE技術首次引入了內標的概念，內標一般由所有樣本等量混合構成，內標中含有來源于所有樣本的每個蛋白質，因此2D－DIGE中每個蛋白點都有它自己的內標，軟件根據每個蛋白點的內標對其表達量進行校準，消除了膠間差異，提高了蛋白質分離的可信度。同時，2DDIGE也采用了“反標”技術，每個樣品都采用Cy3和Cy5交叉標記，降低了不同熒光染料標記導致的系統誤差[5，6]。

本實驗采用2D－DIGE技術研究了髓母細胞瘤腦脊液、室管膜瘤腦脊液及正常腦脊液三者之間的蛋白表達譜。髓母細胞瘤組、室管膜瘤組分別與正常對照組比較，有利于髓母細胞瘤組和室管膜瘤診斷；而髓母細胞瘤與室管膜瘤之間的比較，則有利于二者鑒別診斷。與正常對照組比較，在髓母細胞瘤或室管膜瘤腦脊液中高表達的蛋白質點都是腫瘤標志蛋白的候選蛋白。而僅在髓母細胞瘤或室管膜瘤腦脊液中高表達的蛋白成為腫瘤標志蛋白潛力更大，可以對這些蛋白質點進行下一步質譜鑒定，以明確蛋白名稱。總之，腦脊液雙向熒光差異凝膠電泳方法的成功建立，為髓母細胞瘤與室管膜瘤腦脊液中標志蛋白探尋研究奠定了基礎。

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