3.4聚乳酸－聚三亞甲基碳酸酯／GDNF導管對大鼠脊髓損傷區GAP－43蛋白表達的影響

劉欽毅，程兆華，邵國喜，焦晶雪，王凱鑫

（吉林大學第二醫院 骨科，吉林 長春130041）

許多具有良好化學和物理性質的可降解合成材料，隨著高分子材料學的迅速發展被用于修復脊髓損傷支架的制作，其可以制成想要的形狀和長度。生物可降解材料最終可以恢復自身解剖結構而沒有外源性的物質殘留，使支架在行使其功能后能迅速降解，避免了對神經產生卡壓的可能。其可趨化神經再生，不會引起機體的炎性反應和免疫反應又能為再生微環境提供營養。PLA－PTMC就是其中最普遍應用的一種。

1 材料與方法

1.1 動物和分組

健康 Wistar雌性大鼠，體重220－260g，隨機分成為：正常對照組、完全脊髓橫斷組（A組）和治療組，治療組又按治療方法的不同分為3組，即單一應用GDNF組（B組），單一應用PLA－PTMC導管植入組（C組），應用PLA－PTMC／GDNF復合導管植入組（D組）。每組實驗動物9只，實驗過程中，動物模型出現死亡，分析原因并改正，及時補充，并做標計，按照實驗設計延時完成各項指標的評估。

1.2 PLA－PTMC／GDNF復合導管的制備

稱取適量PLA－PTMC溶于乙酸乙酯中，加入GDNF凍干粉，超聲分散法充分混勻。制成每根導管含GDNF 400U的PLA－PTMC／GDNF復合導管數根。PLA－PTMC導管由濟南健寶開元生物材料有限公司研究中心提供。GDNF由RD公司提供。

1.3 檢測方法

1.3.1 處死動物并取材 每組實驗大鼠均在第2周、4周、6周和8周分別處死3只。斷頭處死后，以損傷節段為中心取新鮮標本，放入凍存管中，存于液氮中，轉至－80℃保存。

1.3.2 實驗步驟 SDS－PAGE 電泳，蛋白印跡（Protein Blotting）按試劑盒說明操作：稱量試驗組織的重量。按照1∶20（g／ml）的比例加入Tis－組織蛋白抽提試劑（含PMSF）并勻漿處理。10，000×g離心5min；收集上清，與上樣緩沖液混合后100度煮沸5min。將得到的硝酸纖維素膜進行拍照，用凝膠圖象處理系統分析目標帶的分子量和灰度值。凝膠成像系統拍照并分析條帶灰度，以灰度比值GAP－43／GAPDH代表GAP－43蛋白的相對水平。

1.4 統計學處理

2 結果

各實驗組大鼠脊髓損傷區及正常對照組脊髓組織中GAP－43蛋白表達水平見表1。以灰度比值GAP－43／GAPDH代表GAP－43蛋白表達的相對水平。術后第2周時，B組、C組和D組GAP－43蛋白表達比正常組增高，P＜0.05；B組、C組和D組各組間GAP－43蛋白的表達水平無顯著性差異，P＞0.05。術后第4周時，其中D組的GAP－43蛋白表達與2周時明顯增高，P＜0.05，并與正常對照組、A組、B組和C組相比有明顯增高，P＜0.05；術后第6周時，各組GAP－43蛋白表達仍增加，但增幅不同，C組和D組與正常對照組、A組、B組相比明顯增高，P＜0.05，D組與C組相比無顯著性差異，P＞0.05；8周時，各組GA－P43蛋白的表達與6周相比均有所均下降，D組與正常對照組及A組、B組和C組相比較仍增高，P＜0.05，見圖1。

表1 各實驗組大鼠脊髓損傷區及正常對照組脊髓組織中GAP－43蛋白表達水平的比較（n＝3，±s）

表1 各實驗組大鼠脊髓損傷區及正常對照組脊髓組織中GAP－43蛋白表達水平的比較（n＝3，±s）

Note：a：with the corresponding week of the normal control group，P＜0.05；4weeks，b：compared with Group A，c：compared with Group B，d：compared with Group C，i：compared with 2weeks＇Group D，P＜0.05；6weeks，e：compared with Group A，f：compared with Group B，P＜0.05；8weeks，j：compared with Group A，k：compared with Group B，l：compared with Group C，P＜0.05.

分組術后時間第2周 第4周 第6周 第8周正常組0.17±0.03 0.18±0.03 0.20±0.04 0.19±0.03 A 組 0.32±0.05a 0.41±0.03a 0.49±0.06a 0.39±0.06a B 組 0.31±0.04a 0.50±0.03a 0.58±0.08a 0.45±0.05a C 組 0.34±0.03a 0.49±0.04a 0.89±0.10aеf 0.43±0.04a D 組 0.36±0.04a 0.78±0.07abcdi 0.91±0.11aеf 0.70±0.07ajkl

圖1 GAP－43在各組大鼠脊髓組織中的表達Western Blot分析

3 討論

脊髓損傷后軸突再生很具有挑戰性，神經損傷區在修復過程中受損處多被致密的疤痕組織占滿，如纖維母細胞、顯形細胞、腦膜細胞和其內的多種抑制因子，當軸突任意在受損處生長[1]。它們可能與靶細胞失去連接，然而利用生物工程方式幫助受損處軸突早期再生以此連接受損處是很有效的，一種方式是創造一個人工生長允許的基底層以此連接受損處神經束，此基底層有兩個面與受損相連起橋梁基底層作用[2]。此種橋梁可由單一生物材料、細胞、組織也可混合生物材料和細胞。

為了更好的了解脊髓損傷修復機制，了解修復過程中脊髓組織分子水平的變化是很必要的，在此我們集中關注GAP－43，因其在脊髓損傷修復中多次被提及，其在神經系統發展、軸突再生、突觸功能的形成起很重要的作用，其表達的顯著與否用量化來描述，基于此目的我們采用Western Blot法觀察各組大鼠脊髓損傷區其量化的變化[4－6]。GAP－43是一種磷酸蛋白質，被認為是神經再生的相關蛋白質和關鍵因子，具有促進神經軸突生長發芽和突觸連接形成作用，在神經系統發育、生長及創傷修復過程中可發揮重要作用。我們通過Western Blot檢測到各組GAP－43在大鼠脊髓中的表達，術后第2周時，A－D組GAP－43蛋白的表達水平與正常對照組明顯增高（P＜0.05）；術后4－6周，D組 GAP－43蛋白的表達水平逐漸增高，6周時最高，8周時下降，此3個時間點上除術后第6周時D組與C組GAP－43蛋白的表達水平無顯著性差異（P＞0.05）外，D組GAP－43蛋白的表達水平與A組、B組、C組相比均有明顯增高（P＜0.05），這與之前用 PT－PCR 法測得的GAP－43mRNA的變化趨勢基本一致。PT－PCR和Western Blot檢測結果與大鼠脊髓完全橫斷損傷模型的行為學分析BBB評分結果基本相符，即D組的GAP－43的mRNA表達和蛋白的表達最高，神經功能恢復最好。Western Blot方法檢測均顯示D組GAP－43表達傷后第2周開始升高，第4周和第6周升高明顯，術后第6周時最高，第8周時下降，但仍較A組、B組和C組增高（P＜0.05）。分析原因考慮PLA－PTMC／GDNF復合導管早期可刺激膠質細胞的增生，而損傷處移行的膠質細胞可以分泌神經營養因子，能夠支持神經元再生。相應地，增強軸突生長的能力，引導軸突延長，促進再生神經細胞遷移，這些都是設計神經修復組織工程支架中的基本因素。PLA－PTMC／GDNF移植可使 GAP－43的表達在大鼠SCI后明顯升高，考慮PLA－PTMC為神經再生提供了良好的微環境。

在本實驗中我們首次應用PLA－PTMC移植修復大鼠脊髓損傷的同時，加入GDNF，結果顯示GDNF同PLA－PTMC導管二者協同作用能更為顯著的促進中樞神經系統的神經再生。PLA－PTMC／GDNF復合導管更有利于軸突再生的修復連接和脊髓損傷的功能恢復。

[1]胡俊勇，李佛保，廖威明，等.大鼠脊髓損傷后神經絲蛋白及膠質纖維酸性蛋白表達的變化及意義[J].中山大學學報（醫學科學），2003，24（2）：129.

[2]Zhang ZX，Casey DM，Julien J P，et al.Normal dendntitic arborization in spinal motoneurons requires neurofilament subunit[J].J Comp Neurol，2002，450（2）：144.

[3]Wu F，Miao X，Chen J，et al.Down－regulation of GAP－43by inhibition of caspases－3in a rat model of neuropathic pain[J].Int J Clin Exp Pathol，2012，5（9）：948.

[4]Novotna I，Slovinska L，Vanicky I，et al.IT delivery of ChABC modulates NG2and promotes GAP－43axonal regrowth after spinal cord injury[J].Cell Mol Neurobiol，2011，31（8）：1129.

[5]Chen LJ，Ren YH，Liu L，et al.Upregulated expression of GAP－43 mRNA and protein in anterior horn motoneurons of the spinal cord after brachial plexus injury[J].Arch Med Res，2010，41（7）：513.