優化玫瑰紅鵝膏培養條件及抑菌活性研究*

張 楠，包海鷹

(吉林農業大學中藥材學院，食藥用菌教育部工程研究中心，吉林 長春 130118)

鵝膏菌是一個世界性分布的大屬，有毒蘑菇中最重要的一類。目前已定名的約有500多種[1]。屬于擔子菌亞門 (Basidiomycotina)、層菌綱 (Hymenomycetes)、傘菌目 (Agaricales)、鵝膏科 (Amanitaceae)、鵝膏屬 (Amanita Pers.:Gray)[2]。鵝膏菌中主要的毒素為肽類毒素，共有3大類22種，分別為鵝膏毒肽 (Amatoxins)9種、鬼筆毒肽 (Phallotoxins)7種和毒傘素 (Vrotoxins)6種。肽類毒素由于獨特的生物學特性，目前廣泛應用于生物學、醫學、遺傳學、生物化學、基因工程，病毒等研究領域[3－5]。由于鵝膏屬大多數與針科或殼斗可形成外生菌根菌[6]，尚無人工栽培。國內毒素來源美國Sigma公司，每毫克價格在1.2×105美元～1.4×105美元。

因為鵝膏屬在真菌中的關鍵性地位以及其毒素的特殊性，人工培養鵝膏菌的努力從來沒有停止過。為了更方便地研究鵝膏菌，人工純培養正在逐步成為一個研究熱點[7]。

依據包海鷹教授多年來對長白山產鵝膏屬真菌的調查研究，以及對7種長白山產鵝膏屬真菌肽類毒素的高效液相分析[8，9]，發現了玫瑰紅鵝膏 A.pallidorosea，其具有資源豐富、毒素含量高等特點。本試驗對玫瑰紅鵝膏進行液體發酵培養，并對發酵產物中的肽類毒素進行分離提取，研究其藥理活性，為毒素獲得提供新的資源，進一步豐富了鵝膏毒肽藥理作用方面的研究內容。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玫瑰紅鵝膏Amanita pallidorosea，采自吉林省輝南縣朝陽鎮樣子哨。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀;色譜分析柱:分析柱YWG－C18柱 (150 mm×4.6 mm，10 μm)，北京分析儀器廠，半制備柱 VenusⅡ MP－C18柱 (250 mm ×10 mm，10 μm)，Agela Technologies;二氧化碳培養箱，NAPCO法國;離心機SORVALL;電子分析天平，SHIMADZU－AUY220型。

1.2.2 試劑

醋酸銨 (美國Sigma公司);乙腈和甲醇 (色譜純);冰醋酸和石油醚 (分析純);洗脫液A相:10%乙腈和90%0.02 mol·L－1醋酸銨，冰醋酸調節pH值至5.0;洗脫液B相:30%乙腈和70%濃度0.02 mol·L－1醋酸銨，冰醋酸調節pH值至5.0;純凈水 (杭州娃哈哈公司)。

標準品:a－鵝膏毒肽 (a－AMA)、β－鵝膏毒肽 (β－AMA)、二羥鬼筆毒肽 [Phalloidin(PHD)]，以上3種標準品均由吉林農業大學菌物研究所提供。

1.3 液體深層培養方法

1.3.1 基礎培養基 (改良PDM)

馬鈴薯 200 g·L－1、葡萄糖 20 g·L－1、磷酸二氫鉀3 g·L－1、硫酸鎂 0.5 g·L－1、磷酸氫氨 0.5 g·L－1、氯化鈣0.05 g·L－1、硝酸鉀 0.1 g·L－1、麥芽汁 (12 波美度)120 mL、VB10.01 g·L－1。

1.3.2 菌種培養

斜面菌種于26℃恒溫培養箱培養10 d后，將適量菌絲接入最適培養基中，然后置于恒溫振蕩器上，150 r·min－1振蕩培養10 d。

搖瓶發酵:250 mL三角瓶裝100 mL培養液，接種量5%(v·v－1)，置于 26℃恒溫振蕩器上，150 r·min－1振蕩培養 25 d。取25 d的發酵菌絲體，于烘箱中60℃烘至恒重，電子天平稱重并記錄。

1.3.3 培養條件優化

試驗設計采用中心組合旋轉設計 (Box－Benhnken)法，對溫度 (A)、pH值 (B)和轉速 (C)進行優化設計。各因素及其編碼水平的設計見表1。

表1 中心組合旋轉設計的變量及水平

1.4 發酵產物中肽類毒素的檢測

1.4.1 粗毒液的制備

菌種培養完成后，將發酵液過濾，收集濾渣和濾液，把菌絲體在60℃下烘干后研磨。取1 g研磨后的菌絲體粉末，溶于10 mL 50%甲醇中，室溫下振蕩抽提24 h，8 000 r·min－1離心收集上清液。沉淀以10 mL 50%甲醇室溫下振蕩抽提24 h，8 000 r·min－1離心收集并合并上清液。用石油醚去脂2次，然后冷凍干燥，凍干的樣品用超純水溶解，再用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得到鵝膏粗毒液。

1.4.2 HPLC測定參數

使用安捷倫1100高效液相色譜儀分離梯度模式為:0→15 min，B 0→5%，A 100%→95%;15 min→35 min，B 5%→80%，A 95%→20%;35 min→40 min，B 80%，A 20%;40 min→45 min，B80%→100%，A20%→0%;45 min→50 min，B 100%;50 min→55 min，B 100%→0%，A 0→100%并保持10 min。純化梯度模式:與分離梯度模式相同。檢測波長:295 nm;柱溫:40℃;流速:分析柱1 mL·min－1;半制備柱:2 mL·min－1。進樣量:分析柱 10 μL，半制備柱 1 mL。

1.4.3 HPLC分離純化

先在分析柱上篩選出最適宜的色譜條件，后在半制備柱上進行毒素的分離和純化，得到2種化合物。冷凍干燥后，用高效液相進行檢測。分離純化結果用Finnigan－MAT.LCQ電噴霧質譜儀進行鑒定。

1.5 對植物病原菌的抑制活性

1.5.1 供試病原真菌

香瓜枯萎病菌 (Fusarium oxysporum)，菌種由吉林農業大學菌物研究所提供。

1.5.2 指示菌的培養

首先將試管斜面保存的菌種接種到PDA平板培養基上，等菌種長好后，用直徑7 mm的打孔器制成菌塊。

1.5.3 供試品對菌絲生長的影響

采用生長速率法[10－12]。取質量濃度為 105 μg·mL－1的粗提物溶液200 μL，混合于100 mL的PDA培養基中，配制以下濃度的含毒培養基，即玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液:200 μg·mL－1[13]、100 μg·mL－1、50 μg·mL－1;發酵產物:800 μg·mL－1、400 μg·mL－1、200 μg·mL－1;不添加任何供試品的平板培養基作為空白對照。每個樣品設置3個重復。將已制好的菌塊接種于含毒的平板培養基中，置于26℃的培養箱中培養7 d。然后，用十字交叉法測抑菌率 (%)，公式為:

式中:R1為對照菌落直徑;R2為處理菌落直徑。

1.5.4 數據統計分析

所有數據采用SPSS17.0統計軟件進行處理，計數資料采用x±SD表示。p＜0.05說明在統計學上呈顯著差異，p＜0.01說明在統計學上呈極顯著差異，有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 液體深層培養

2.1.1 不同溫度對菌絲體重量的影響

設置20℃、23℃、26℃、30℃、33℃、36℃共計5個不同的溫度處理 (溫度變幅為±1℃)，結果見圖1。

結果表明，玫瑰紅鵝膏菌絲體在26℃下培養，菌絲體干物質重量最高，生長狀態最好。當溫度達到33℃時，菌絲體生長極其緩慢，當溫度達到36℃時，菌絲體基本停止生長。可能溫度過高會導致菌體內的酶活性降低或者喪失。

2.1.2 不同pH值對菌絲體重量的影響

設置4、5、6、7、8共計5個不同的 pH值處理。用1 mol·L－1的HCl和NaOH調節培養基的pH值，結果見圖2。

結果表明，玫瑰紅鵝膏菌絲體在pH值為6的條件培養時，菌絲體干物質重量最高。

2.1.3 不同轉速對菌絲體重量的影響

設置 80 r·min－1、100 r·min－1、120 r·min－1、140 r·min－1、160 r·min－1共計5個不同的轉速處理，結果見圖3。

結果表明，玫瑰紅鵝膏菌絲體在140 r·min－1振蕩培養時，菌絲體干物質重量最高。

2.1.4 Box－Benhnken實驗分析

中心組合旋轉試驗設計及結果見表2。

表2 中心組合旋轉試驗設計及結果

本試驗以玫瑰紅鵝膏菌絲體干重 (g)為響應變量，以溫度 (A)、pH值 (B)和轉速 (C)為影響因子，進行 Box－Behnken響應面分析，利用統計軟件SAS8.0對試驗結果進行統計分析，可建立二次回歸方程 (編碼后):

Y=+1.00－0.018×A+0.020×B+0.068×C+0.052×A×B+5.500E－003×A×C+0.055×B×C－0.15×A2－0.16×B2－0.061×C2，相關系數 R2=99.67%，修正相關系數 R2Adj=99.24%。

對二次回歸方程進行方差分析，結果見表3。

表3 二次回歸方程方差分析表

回歸模型達到極顯著水平 (p＜0.01)而誤項不顯著，說明回歸方程與實際情況較吻合，試驗誤差小，因此可利用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結果進行分析。由表3可知，模型的一次項A、B、C極顯著;二次項均極顯著;交互項AB、BC極顯著，AC不顯著。這表明各種因素對于菌絲體重量的影響不是簡單的線性關系。

2.1.5 因素間的交互作用

根據回歸方程并利用Design－Expert軟件作不同因素的響應面分析圖和等高線圖，溫度、pH值和轉速三因素及其交互作用對菌絲體重量的影響結果通過圖4～圖6直接反應出來。

結果表明，等高線的形狀可以反映出因素間交互效應的強弱，圓形表示兩因素間的交互效應不顯著，橢圓形表示顯著。

2.1.6 玫瑰紅鵝膏發酵條件的優化與結果驗證

對方程Y=+1.00－0.018×A+0.020×B+0.018×C+0.052×A×B+5.500E－003×A×C+0.055×B×C－0.15×A2－0.16×B2－0.061×C2，最優培養條件為溫度25℃、pH值6、轉速為156 r·min－1，其所得玫瑰紅鵝膏菌絲體干重為1.034 g。

2.1.7 回歸模型驗證試驗

根據最優培養條件對模型進行驗證，3次平行驗證試驗所得玫瑰紅鵝膏菌絲體干重均值為1.054 g，優化后提高了1.02倍，實際值與預測值的誤差為+2.8%。表明響應面法優化玫瑰紅鵝膏最佳培養條件是有效可行的。

2.2 發酵產物中肽類毒素的檢測

將菌絲體粗提物液通過液相進行分離純化。液相保留時間，因不同的分離條件和不同的色譜柱，保留時間有一定的差異，但是各個化合物在液相上的出峰順序保持不變。同時根據液相色譜質譜聯用儀和內標法確定化合物，得到2個化合物，但是其含量較低。化合物1在分析柱上檢測結果如圖7所示。

檢測化合物1保留時間是11.41 min，純度較高。電噴霧質譜[M+Na]峰是941，MW是918(圖8)。根據色譜保留時間和分子量，判斷組分為α－鵝膏毒肽 (α－AMA)，分子式為C39H54N10O14S。

化合物2在分析住上檢測結果如圖9所示，檢測化合物2保留時間是7.92 min。電噴霧質譜 [M－H]峰是918，MW是919(圖10)。根據色譜保留時間和分子量，判斷組分為β－鵝膏毒肽 (β－AMA)，分子式C39H53N9O15S。

2.3 對植物病原菌的抑制活性

2.3.1 玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液對香瓜枯萎病菌的抑制作用

玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液對香瓜枯萎病菌的抑制作用見表4。

表4 玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液對香瓜枯萎病菌抑制作用 (n=3)

由表4可以看出，鵝膏粗毒液對香瓜枯萎病菌的抑制作用呈量效關系。濃度為 200 μg·mL－1時抑制率最高，為42.47%，100 μg·mL－1時作用力次之，50 μg·mL－1時抑制率最低，且與空白組對比呈極顯著差異 (p＜0.01)。

2.3.2 發酵產物對香瓜枯萎病菌的抑制作用

發酵產物對香瓜枯萎病菌的抑制作用見表5。

表5 發酵產物對香瓜枯萎病菌的抑制作用 (n=3)

由表5可知，發酵產物對香瓜枯萎病菌的抑制作用呈量效關系。濃度為800 μg·mL－1時抑制率最高，為 21.29%;400 μg·mL－1時作用力次之，且與空白組對比呈極顯著差異(p ＜0.01);200 μg·mL－1時抑制率為 0。

3 討論

經過響應面方法優化，獲得了最佳培養條件，即溫度為25℃，pH值為6，轉數為156 r·min－1。此培養條件更適合玫瑰紅鵝膏菌絲體的生長。同時，在其發酵產物中檢測到2種毒素α－AMA和β－AMA。但是毒素含量較低，如何提高發酵產物中的毒素含量有待于更進一步的研究。

玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液和發酵產物對香瓜枯萎病菌有不同的抑制作用。當子實體濃度為200 μg·mL－1時抑制率最高，為42.47%。可能是肽類毒素對植物病原菌有抑制作用，因為玫瑰紅鵝膏子實體粗毒液和發酵產物中的肽類毒素的含量不同，造成了抑菌效果的差異。鵝膏肽類毒素影響真菌細胞內RNA聚合酶Ⅱ的活性，進而抑制了真菌細胞內DNA和RNA的合成，繼而阻礙了蛋白質的合成，從而導致了細胞的死亡[14，15]。其作為新型的生物農藥有待于更進一步的研究和應用。

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