熱纖梭菌內切β—1，4—葡聚糖酶的克隆與表達

彭靜靜

摘要：將來源于熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）ATCC 27405的編碼內切β-1，4-葡聚糖酶的結構基因（celD）與熱激表達載體pHsh連接，得到重組表達載體pHsh-celD，并將重組表達載體pHsh-celD轉入到大腸桿菌Escherichia coli BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中。結果表明，該重組酶的分子質量為66 ku，與預期大小相符。基于表達載體pHsh的重組表達系統具有誘導表達簡便、誘導方式廉價的優點，且重組酶熱穩定性非常好，對該酶的大規模發酵應用具有重要意義。

關鍵詞：熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）；纖維素酶；表達載體pHsh；克隆；表達

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4457-03

纖維素是地球上分布最廣、蘊藏量最豐富的生物質，也是最廉價的可再生資源。纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶，能分解纖維素產生寡糖和纖維二糖，水解成為葡萄糖[1]。隨著纖維素酶在工業上廣泛地應用，特別是在紡織工業、能源工業中，纖維素酶已成為最近十幾年酶工程研究的一個焦點。熱纖梭菌（Clostridium thermocellum）ATCC 27405是一種高溫厭氧細菌，其合成的纖維素酶和半纖維素酶構成多酶復合體，纖維素酶主要是由內切β-1，4-葡聚糖酶（C1酶）、外切β-l，4-葡聚糖酶（Cx酶）和葡萄糖苷酶3種酶組成的。其中，內切β-l，4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.4）是分解纖維素最主要的酶。嗜熱梭菌（Clostridium sp.）產生的纖維素酶耐熱性好，但是由于熱纖梭菌是一種嚴格的厭氧菌，培養條件極其苛刻，分泌纖維素酶必須在高度厭氧的條件下進行，且酶產量相對較低，不適合在工業中大規模發酵生產。而采用分子生物學手段，將嗜熱酶基因導入大腸桿菌（Escherichia coli）中高效表達是非常有效的方法[2-5]。

本試驗克隆了編碼內切β-1，4-葡聚糖酶的結構基因（celD），并連接到熱激表達載體pHsh上，得到重組質粒pHsh-celD，并實現了此纖維素酶在大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中高效表達，為該酶在工業上的開發及利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

熱纖梭菌ATCC 27405（購于美國菌種保藏中心）采用厭氧培養基培養，55 ℃靜置培養8 h[6，7]。表達載體pHsh由泰山學院生物與釀酒工程學院構建并保存，屬于熱激表達載體。該表達載體是由大腸桿菌σ32因子調控，包括一個熱激啟動子和終止子，通過熱激誘導外源基因表達[8，9]。

1.2 方法

1.2.1 celD基因的克隆與重組表達載體的構建 根據GenBank上已提交的熱纖梭菌ATCC 27405纖維素酶基因（NC_009012）的序列，利用信號肽預測利用在線SignalP 3.0軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）設計了PCR擴增引物N-1：5′-AGACCAAAGTGTCAGCTGC-3′和C-1：5′-CCCCTCGAGTATTGGTAATTTCTCGATTAC-3′。以提取的熱纖梭菌ATCC 27405的基因組DNA為模板，進行PCR擴增celD基因。PCR擴增程序為：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性25 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，切膠回收純化目的DNA片段。將經Xho I酶切PCR回收產物和經Stu I和Xho I雙酶切的表達載體pHsh連接，將連接產物電擊轉化入大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中，構建含celD基因的重組表達載體pHsh-celD。

1.2.2 重組蛋白的表達與純化 重組質粒pHsh-celD電轉化到大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中，挑取重組單菌落接種于含100 μg/mL的Amp的LB培養液中30 ℃振蕩培養。當培養至OD600 nm為0.6～0.8時轉入42 ℃水浴搖床進行熱激表達繼續培養8 h后離心收集菌體。用50 mmol/L pH 7.5的Tris-HCl緩沖液洗滌細胞2次后，用相同緩沖液重懸細胞，置于冰浴中用超聲波破碎儀破碎細胞。細胞碎片于12 000 r/min離心10 min，去除上清液即為粗酶液。將粗酶液在60 ℃熱處理30 min后，4 ℃、12 000 r/min離心30 min去除變性蛋白。

2 結果與分析

2.1 celD基因的克隆與序列分析

熱纖梭菌ATCC 27405于厭氧管中55 ℃靜置培養8 h后，提取基因組DNA，并經瓊脂糖凝膠電泳驗證，結果如圖1A所示。根據GenBank上已提交的熱纖梭菌ATCC 27405纖維素酶基因（NC_009012）的序列大小為1 950 bp，PCR擴增celD基因的結果如圖1B所示，PCR擴增片段與預期大小（1 848 bp）相符。

2.2 重組表達載體pHsh-celD的構建

PCR擴增得到celD基因片段經Xho I單酶切后純化，與經過Stu I和Xho I雙酶切的表達載體pHsh連接，得到重組表達載體pHsh-celD，其酶切鑒定結果如圖2所示。

2.3 重組纖維素酶的表達及檢測

將重組表達載體pHsh-celD電轉化到大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中，挑取重組單菌落接種于含100 μg/mL Amp的LB培養液中30 ℃振蕩培養。當培養至OD600 nm為0.6～0.8時轉入42 ℃水浴搖床進行熱激表達繼續培養8 h后離心收集菌體。SDS-PAGE分析結果（圖3）表明，重組菌均能產生約66 ku的特異條帶，與預期的蛋白質相對分子質量大小一致。endprint

3 小結與討論

本研究采用了熱激載體pHsh作為表達載體，將來源于熱纖梭菌的內切β-1，4-葡聚糖酶基因在大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中成功表達。該表達載體是由大腸桿菌σ32因子調控，包括一個熱激啟動子和終止子，通過熱激就可以高效地表達外源基因，所以在誘導外源基因表達過程中就不需要加入化學誘導劑。化學誘導劑如IPTG比較昂貴，是基因工程菌株在工業化應用中的一個瓶頸問題，而熱激誘導能很好地降低了基因誘導表達成本，這無疑在工業化應用中具有巨大的優越性和現實意義[9，10]。本研究中利用熱纖梭菌的纖維素酶耐熱性，將重組菌細胞破碎后的上清液經過60 ℃的熱處理后，純化出了可用于工業應用的纖維素酶，極大地降低了下游處理成本。由于該酶的編碼基因含有較多的稀有密碼子，因此下一步考慮將其基因的稀有密碼子進行定點突變成大腸桿菌的優勢密碼子，通過對表達質粒的TIR區域進行mRNA二級結構分析后，優化mRNA二級結構，以進一步提高其表達水平。

參考文獻：

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3 小結與討論

本研究采用了熱激載體pHsh作為表達載體，將來源于熱纖梭菌的內切β-1，4-葡聚糖酶基因在大腸桿菌BL21-CodonPlus（DE3）-RIL中成功表達。該表達載體是由大腸桿菌σ32因子調控，包括一個熱激啟動子和終止子，通過熱激就可以高效地表達外源基因，所以在誘導外源基因表達過程中就不需要加入化學誘導劑。化學誘導劑如IPTG比較昂貴，是基因工程菌株在工業化應用中的一個瓶頸問題，而熱激誘導能很好地降低了基因誘導表達成本，這無疑在工業化應用中具有巨大的優越性和現實意義[9，10]。本研究中利用熱纖梭菌的纖維素酶耐熱性，將重組菌細胞破碎后的上清液經過60 ℃的熱處理后，純化出了可用于工業應用的纖維素酶，極大地降低了下游處理成本。由于該酶的編碼基因含有較多的稀有密碼子，因此下一步考慮將其基因的稀有密碼子進行定點突變成大腸桿菌的優勢密碼子，通過對表達質粒的TIR區域進行mRNA二級結構分析后，優化mRNA二級結構，以進一步提高其表達水平。

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