1株西沙群島野生諾尼種子內生細菌CICC 10599的分離與鑒定*

劉洋，曹艷花，姚粟，翟磊，張明娟，張欣，程池

(中國食品發酵工業研究院中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

諾尼(Morinda citrifolia L.)，又稱為海巴戟天、諾麗、蘿梨、四季果或印桑椹等，是一種生長于熱帶、亞熱帶的茜草科植物，原產于亞洲、澳大利亞及一些太平洋島嶼，富含160余種營養成分，具有非常獨特的保健功效與藥用價值［1］。國內外已有眾多關于諾尼植物對多種病癥具有顯著療效的科學研究報道［2］，諾尼保健食品已被人們用來輔助治療多種疾病。

植物內生細菌是能夠在健康植物組織內棲居而對植物不造成實質性危害而與植物建立了和諧聯合關系的微生物［3］，其中不乏能夠促進植物生長健康及功效性成分產生的有益微生物種類［4］。本研究以自西沙群島野生諾尼種子中分離篩選得到的內生細菌菌株CICC 10599為研究對象，對其進行多相分類學鑒定與分析，旨在為進一步了解其生物功能及其相關機制奠定微生物資源基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株分離自我國西沙群島野生諾尼種子(采集自中國海南省三沙市永興島，具體位置為東經112.34°，北緯16.83°)中分離獲得，并保藏于中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)，保藏編號為CICC 10599。

1.1.2 培養基

LB培養基(蛋白胨 10.0 g，酵母粉 5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂 15.0 g，蒸餾水 1.0L，pH7.0)。

1.1.3 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP、D2000 Marker購自天根生化科技有限公司;GoldView購自北京塞百盛基因技術有限公司;溶菌酶購自Sigma公司、蛋白酶K購自Merk公司;API 50 CHB和API 20E試劑條購自法國梅里埃公司;其他化學藥品均為進口分析純產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株分離

在限菌條件下稱取10 g野生諾尼種子，放入盛有90 mL無菌水帶玻璃珠的三角瓶中，充分振蕩20 min，之后靜置5 min。采用梯度稀釋法制備10－2到10－6的系列稀釋液，分別涂布到LB培養基中置于30℃下培養48h。挑取單菌落轉接到新鮮的LB斜面上于4℃保藏。

1.2.2 形態學觀察

將供試菌株接種于LB固體培養基，置于30℃培養48h后，觀察其在LB培養基上的培養特征;并利用光學顯微鏡及電子顯微鏡進行菌體特征觀察［5］。

1.2.3 生理生化特征API檢測

采用API 20E及API 50CH試劑條對菌株CICC 10599的酶活性、碳源利用及其產酸情況等生理生化特征進行檢測，具體操作方法按試劑條說明書進行。

1.2.4 16 S rRNA基因序列分析

利用細菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen公司)提取菌株CICC 10599基因組DNA，具體步驟參見試劑盒說明書，提取的基因組DNA用0.8%的瓊脂糖進行檢測。

以基因組DNA為模板，利用通用引物對16S rRNA基因進行擴增。引物序列為:正向引物27f(5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇)，反向引物 1492r(5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇)［5］。50 μL PCR 反應體系:50 ng DNA模板，1×Taq reaction buffer，引物各20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 單位 Taq 酶(Ferments)。反應程序為:94℃預變性5 min，94℃變性1 min，52℃復性1 min，72℃延伸1 min 30 s，30個循環后72℃延伸10 min。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖進行檢測。純化后的PCR產物用ABI 3700基因測序儀測序。測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。測序結果用Chromas軟件參照正反序列圖譜人工校對。將測序得到的結果在EzTaxon server 2.1數據庫中進行比對［6］，確定與已知近緣種序列的相似性。采用CLUSTAL W對CICC10599及其若干近緣種16S rRNA基因序列進行多序列比對［7］，并利用N-J法通過MEGA 5軟件進行系統發育及分子進化分析［8］。

1.2.5 DNA促旋酶B亞基基因(gyrB gene)序列分析

以提取獲得的菌株CICC 10599基因組DNA為模板，利用特異性引物DNA促旋酶B亞基基因(gyrB gene)進行擴增，上游引物(BC-gyrB-f)為 5＇-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3＇，下游引物(BC-gyrB-r)為 5＇-AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCN GTCAT-3＇［9］。50 μL PCR反應體系:50 ng DNA模板，1× Taq reaction buffer，引物各 20 pmol，20 μmol dNTP，1.5單位Taq酶(Ferments)。反應程序為:94℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50℃復性30 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30個循環后72℃延伸10 min。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖進行檢測。純化后的PCR產物用ABI 3700基因測序儀測序。引物合成及測序均由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。測序得到的結果在GenBank數據庫中進行比對。

2 結果

2.1 形態學觀察

菌株CICC 10599在LB培養基上菌落呈黃色，圓形，邊緣不整齊，表面光滑并凸起(見圖1a);利用光學顯微鏡觀察顯示菌體細胞桿狀，單個排列，大小為0.4 μm ×(0.9～1.5)μm，革蘭氏陰性(見圖1b)。菌體電子顯微鏡成像效果見圖1c和1d。

2.2 生理生化特征鑒定

經API 20E及API 50CH試劑條對菌株CICC 10599的酶活性、碳源利用及其產酸情況等生理生化特征進行檢測，結果顯示CICC 10599能夠水解明膠和利用檸檬酸鹽;具有β-半乳糖苷酶活性;并能夠利用葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露醇、肌醇、鼠李糖、麥芽糖、蔗糖、蜜二糖、阿拉伯糖等多種碳源物質，結果見表1。

圖1 菌株CICC 10599形態學觀察結果Fig.1 Morphological observation of strain CICC 10599

2.3 16S rRNA基因序列分析

菌株CICC 10599的基因組DNA提取結果見圖2。所提取的DNA片段約為23 kb，利用引物27f和1492r擴增得到16S rRNA基因全長序列，結果顯示，PCR產物僅有一條帶，大小約為1500 bp(見圖3)。擴增產物經測序及分析處理后，將序列信息提交至Gen-Bank，登錄號為 KJ562862。以 Escherichia coli KCTC 2441T(EU014689)為外群，構建CICC 10599與相關近緣模式菌株的系統發育樹(圖4)。由系統發育分析可斷，菌株CICC 10599歸屬為泛菌屬(Pantoea sp.)。

圖2 CICC 10599基因組DNAFig.2 CICC 10599 Genomic DNA

2.4 DNA促旋酶B亞基基因的克隆與序列分析

DNA促旋酶B亞基基因(gyrB gene)可作為泛菌屬內各菌種間分子生物學鑒定的重要判據之一［10］。以菌株CICC 10599的基因組DNA為模版，利用特異性引物(BC-gyrB-f/BC-gyrB-r)對DNA促旋酶B亞基基因進行擴增，結果如圖5所示，擴增片段大小約為1300 bp左右，產物經測序及分析處理后，將序列信息提交至GenBank，登錄號為KJ562866。將DNA促旋酶B亞基基因序列在GenBank中進行Blast比對，與分散泛菌(Pantoea dispersa)DNA促旋酶B亞基基因序列的相似度為99%，而與泛菌屬中的其他近緣種的相似度均不高于90%。

圖3 CICC 10599 16S rRNA基因擴增產物Fig.3 CICC 10599 16S rRNA gene PCR amplifi cation

圖4 CICC 10599 16S rRNA基因系統發育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CICC 10599 16S rRNA gene

2.5 菌株CICC 10599分類鑒定結論

圖5 CICC 10599DNA促旋酶B亞基基因PCR擴增產物Fig.5 CICC 10599 gyr B gene PCR amplification

通過形態學觀察，生理生化特征鑒定，16S rRNA基因序列系統發育分析及持家基因——DNA促旋酶B亞基基因的比對分析，并結合相關文獻報道［11］，西沙群島野生諾尼種子內生細菌菌株CICC 10599被鑒定為分散泛菌(Pantoea dispersa)。

3 討論

本文采用多相分類(polyphasic taxonomy)鑒定技術對我國西沙群島野生諾尼種子內生細菌菌株CICC 10599進行“種”水平分類地位的鑒定。多相分類的概念最早是由Colwell［12］提出的，綜合利用微生物多種不同信息，包括表型、基因型和系統發育分析，對微生物進行分類的方法，已廣泛應用于微生物分類學研究領域。

本研究利用細菌通用引物27f和1492r對菌株CICC 10599的16S rRNA基因序列擴增和序列測定，并通過GenBank數據庫進行分析比較和利用MEGA 5進行系統進化分析，CICC 10599被鑒定為泛菌屬(Pantoea sp.)。以基因系統發育分析為基礎，結合形態及培養特征觀察、生理生化試驗及持家基因——DNA促旋酶B亞基基因序列分析結果，并參考相關文獻報道［11］，最終確定 CICC 10599為分散泛菌(Pantoea dispersa)。

分散泛菌(P.dispersa)由 Gavini等［11］于1989年首次分離得到并命名和描述;洪永聰等［13］自稻谷上分離獲得的分散泛菌對水稻白葉枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzae)具有良好的拮抗作用，但自諾尼植物中被發現并分離得到本研究尚屬首次，鑒于該菌作為分離自野生諾尼種子內生細菌群落中的優勢菌，可以推測該菌在諾尼植物生長發育及功效性成分物質產生方面具有不可忽視的作用。對其進行全面、準確的多相分類學鑒定是研究其生物學功能的必要前提。此外，本研究還針對CICC 10599進行碳源物質利用情況及相關酶的活性進行研究，確定其具有β-半乳糖苷酶的活性，并能夠利用葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、麥芽糖、蔗糖及阿拉伯糖等近30種碳源物質，為進一步發揮該菌的生物學功能和實現其生產利用價值奠定重要的基礎。

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