基于酶抑制原理的電噴霧質譜法快速篩查蔬菜中氨基甲酸酯類農藥殘留

羅輝泰　黃曉蘭　吳惠勤　張立　郭寅龍　朱志鑫　黃芳　林曉珊

摘要采用電噴霧質譜（ESIMS），通過測定乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）的抑制率，建立了蔬菜中氨基甲酸酯類農藥（Carbamate pesticides， CBPs）殘留的快速篩查方法。樣品經QuEChERS方法簡單處理后，以硫代乙酰膽堿為底物，與AChE發生酶促反應，用ESIMS法測定底物轉化成產物硫代膽堿的轉化率， 進而計算得到AChE的抑制率。本實驗優化了酶促反應溫度、時間及濃度等條件，考察了10種常見CBPs農藥濃度與AChE抑制率的關系，研究了實際蔬菜樣品存在的基質效應，以不含農藥的空白蔬菜樣品的酶抑制率的3倍確立了方法的檢出限。結果表明，方法檢出限可達到0.01～0.05 mg/kg，優于現行的農藥殘留快速篩查國家標準，完全滿足食品安全國家標準對食品中農藥最大殘留限量的要求，且具有良好的抗基質干擾能力，可有效避免假陽性結果的出現，并通過了液相色譜串聯質譜法的驗證。本方法簡便快速、靈敏可靠，適用于蔬菜中氨基甲酸酯類農藥的快速、高通量篩查。關鍵詞酶抑制； 電噴霧質譜； 蔬菜； 氨基甲酸酯類農藥； 快速篩查； 高通量

氨基甲酸酯類農藥（CBPs）自問世以來，因其具有選擇性強、殺蟲譜廣等特點＼[1＼]，被廣泛用于防治植物病蟲害，對提高農作物產率，促進農業經濟發展起到非常重要的作用。但近年來，由于氨基甲酸酯類農藥的長期使用、濫用或超量使用，導致蔬菜水果等植物源性食品中殘留農藥超標嚴重，由此而造成的農藥急慢性中毒事件時有發生。這類農藥通過抑制體內乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性，使其不能分解乙酰膽堿（ACh）而導致組織中乙酰膽堿過量蓄積，引起人體中樞神經系統癥狀甚至導致死亡＼[2＼]。為了避免此類中毒事件的發生和實現農產品中殘留農藥的有效監測，建立蔬菜水果中快速、靈敏的氨基甲酸酯類農藥檢測方法顯得異常迫切。

目前，已有許多分析方法用于氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測，如生物傳感器[3]、液相色譜法＼[4，5＼]、氣相色譜法＼[6＼]、氣相色譜質譜法＼[7＼]及液相色譜串聯質譜法＼[8～10＼]等。由于大多數CBPs屬于難揮發化合物，氣相色譜法或氣相色譜質譜法只能檢測少數幾種CBPs； 對于基質復雜的樣品，液相色譜法的靈敏度和可靠性均難以達到要求； 而最適宜分析CBPs的液相色譜串聯質譜法，其分析時間也較長，且需要提供目標農藥標準品做對照，無法實現快速高通量測試。

氨基甲酸酯類農藥的快速檢測方法是基于CBPs對AChE抑制的原理。AChE具有催化乙酰膽堿水解成膽堿的作用，過程如圖1所示，而一旦CBPs與其結合，將使其失去催化反應能力。因而，CBPs的殘留可以通過AChE活性被抑制的情況間接進行測定。目前，基于此原理測定農殘的方法主要有速測卡法＼[11＼]、分光光度法＼[12，13＼]、pH法＼[13＼] 、酶生物傳感器法＼[14＼]。然而，前3種方法靈敏度過低，且極易受樣品基質干擾而出現假陽性結果； 酶生物傳感器法雖然其靈敏度較高，但步驟多且繁瑣。與現有方法相比，質譜儀因具有快速、準確、靈敏、抗基質干擾能力強等多方面優勢，已開始用于酶活測定。如Xu等＼[15＼]采用基質輔助激光解析離子化傅立葉變換質譜（MALDIFTMS），通過測定AChE底物及其產物的含量實現了酶活的測定，建立了基于此技術的有機磷農藥篩查方法＼[16～18＼]，這種方法具有快速、高通量、高靈敏度的優勢，但由于MALDIFTMS儀器成本高昂，普及率低，方法難以推廣應用。另外，目前還未見基于此原理的質譜法測定氨基甲酸酯類農藥的報道。本實驗采用已較為普及的電噴霧質譜（ESIMS），建立基于酶抑制原理的快速篩查蔬菜中氨基甲酸酯類農藥殘留的新方法，該法在滿足快速、靈敏、高通量要求的同時，大大降低了篩查成本，便于方法的推廣應用。迄今為止，采用ESIMS，通過測定AChE活性，快速篩查CBPs的方法尚未見報道。

摘要采用電噴霧質譜（ESIMS），通過測定乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）的抑制率，建立了蔬菜中氨基甲酸酯類農藥（Carbamate pesticides， CBPs）殘留的快速篩查方法。樣品經QuEChERS方法簡單處理后，以硫代乙酰膽堿為底物，與AChE發生酶促反應，用ESIMS法測定底物轉化成產物硫代膽堿的轉化率， 進而計算得到AChE的抑制率。本實驗優化了酶促反應溫度、時間及濃度等條件，考察了10種常見CBPs農藥濃度與AChE抑制率的關系，研究了實際蔬菜樣品存在的基質效應，以不含農藥的空白蔬菜樣品的酶抑制率的3倍確立了方法的檢出限。結果表明，方法檢出限可達到0.01～0.05 mg/kg，優于現行的農藥殘留快速篩查國家標準，完全滿足食品安全國家標準對食品中農藥最大殘留限量的要求，且具有良好的抗基質干擾能力，可有效避免假陽性結果的出現，并通過了液相色譜串聯質譜法的驗證。本方法簡便快速、靈敏可靠，適用于蔬菜中氨基甲酸酯類農藥的快速、高通量篩查。關鍵詞酶抑制； 電噴霧質譜； 蔬菜； 氨基甲酸酯類農藥； 快速篩查； 高通量

氨基甲酸酯類農藥（CBPs）自問世以來，因其具有選擇性強、殺蟲譜廣等特點＼[1＼]，被廣泛用于防治植物病蟲害，對提高農作物產率，促進農業經濟發展起到非常重要的作用。但近年來，由于氨基甲酸酯類農藥的長期使用、濫用或超量使用，導致蔬菜水果等植物源性食品中殘留農藥超標嚴重，由此而造成的農藥急慢性中毒事件時有發生。這類農藥通過抑制體內乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性，使其不能分解乙酰膽堿（ACh）而導致組織中乙酰膽堿過量蓄積，引起人體中樞神經系統癥狀甚至導致死亡＼[2＼]。為了避免此類中毒事件的發生和實現農產品中殘留農藥的有效監測，建立蔬菜水果中快速、靈敏的氨基甲酸酯類農藥檢測方法顯得異常迫切。

目前，已有許多分析方法用于氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測，如生物傳感器[3]、液相色譜法＼[4，5＼]、氣相色譜法＼[6＼]、氣相色譜質譜法＼[7＼]及液相色譜串聯質譜法＼[8～10＼]等。由于大多數CBPs屬于難揮發化合物，氣相色譜法或氣相色譜質譜法只能檢測少數幾種CBPs； 對于基質復雜的樣品，液相色譜法的靈敏度和可靠性均難以達到要求； 而最適宜分析CBPs的液相色譜串聯質譜法，其分析時間也較長，且需要提供目標農藥標準品做對照，無法實現快速高通量測試。

氨基甲酸酯類農藥的快速檢測方法是基于CBPs對AChE抑制的原理。AChE具有催化乙酰膽堿水解成膽堿的作用，過程如圖1所示，而一旦CBPs與其結合，將使其失去催化反應能力。因而，CBPs的殘留可以通過AChE活性被抑制的情況間接進行測定。目前，基于此原理測定農殘的方法主要有速測卡法＼[11＼]、分光光度法＼[12，13＼]、pH法＼[13＼] 、酶生物傳感器法＼[14＼]。然而，前3種方法靈敏度過低，且極易受樣品基質干擾而出現假陽性結果； 酶生物傳感器法雖然其靈敏度較高，但步驟多且繁瑣。與現有方法相比，質譜儀因具有快速、準確、靈敏、抗基質干擾能力強等多方面優勢，已開始用于酶活測定。如Xu等＼[15＼]采用基質輔助激光解析離子化傅立葉變換質譜（MALDIFTMS），通過測定AChE底物及其產物的含量實現了酶活的測定，建立了基于此技術的有機磷農藥篩查方法＼[16～18＼]，這種方法具有快速、高通量、高靈敏度的優勢，但由于MALDIFTMS儀器成本高昂，普及率低，方法難以推廣應用。另外，目前還未見基于此原理的質譜法測定氨基甲酸酯類農藥的報道。本實驗采用已較為普及的電噴霧質譜（ESIMS），建立基于酶抑制原理的快速篩查蔬菜中氨基甲酸酯類農藥殘留的新方法，該法在滿足快速、靈敏、高通量要求的同時，大大降低了篩查成本，便于方法的推廣應用。迄今為止，采用ESIMS，通過測定AChE活性，快速篩查CBPs的方法尚未見報道。

摘要采用電噴霧質譜（ESIMS），通過測定乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）的抑制率，建立了蔬菜中氨基甲酸酯類農藥（Carbamate pesticides， CBPs）殘留的快速篩查方法。樣品經QuEChERS方法簡單處理后，以硫代乙酰膽堿為底物，與AChE發生酶促反應，用ESIMS法測定底物轉化成產物硫代膽堿的轉化率， 進而計算得到AChE的抑制率。本實驗優化了酶促反應溫度、時間及濃度等條件，考察了10種常見CBPs農藥濃度與AChE抑制率的關系，研究了實際蔬菜樣品存在的基質效應，以不含農藥的空白蔬菜樣品的酶抑制率的3倍確立了方法的檢出限。結果表明，方法檢出限可達到0.01～0.05 mg/kg，優于現行的農藥殘留快速篩查國家標準，完全滿足食品安全國家標準對食品中農藥最大殘留限量的要求，且具有良好的抗基質干擾能力，可有效避免假陽性結果的出現，并通過了液相色譜串聯質譜法的驗證。本方法簡便快速、靈敏可靠，適用于蔬菜中氨基甲酸酯類農藥的快速、高通量篩查。關鍵詞酶抑制； 電噴霧質譜； 蔬菜； 氨基甲酸酯類農藥； 快速篩查； 高通量

氨基甲酸酯類農藥（CBPs）自問世以來，因其具有選擇性強、殺蟲譜廣等特點＼[1＼]，被廣泛用于防治植物病蟲害，對提高農作物產率，促進農業經濟發展起到非常重要的作用。但近年來，由于氨基甲酸酯類農藥的長期使用、濫用或超量使用，導致蔬菜水果等植物源性食品中殘留農藥超標嚴重，由此而造成的農藥急慢性中毒事件時有發生。這類農藥通過抑制體內乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性，使其不能分解乙酰膽堿（ACh）而導致組織中乙酰膽堿過量蓄積，引起人體中樞神經系統癥狀甚至導致死亡＼[2＼]。為了避免此類中毒事件的發生和實現農產品中殘留農藥的有效監測，建立蔬菜水果中快速、靈敏的氨基甲酸酯類農藥檢測方法顯得異常迫切。

目前，已有許多分析方法用于氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測，如生物傳感器[3]、液相色譜法＼[4，5＼]、氣相色譜法＼[6＼]、氣相色譜質譜法＼[7＼]及液相色譜串聯質譜法＼[8～10＼]等。由于大多數CBPs屬于難揮發化合物，氣相色譜法或氣相色譜質譜法只能檢測少數幾種CBPs； 對于基質復雜的樣品，液相色譜法的靈敏度和可靠性均難以達到要求； 而最適宜分析CBPs的液相色譜串聯質譜法，其分析時間也較長，且需要提供目標農藥標準品做對照，無法實現快速高通量測試。

氨基甲酸酯類農藥的快速檢測方法是基于CBPs對AChE抑制的原理。AChE具有催化乙酰膽堿水解成膽堿的作用，過程如圖1所示，而一旦CBPs與其結合，將使其失去催化反應能力。因而，CBPs的殘留可以通過AChE活性被抑制的情況間接進行測定。目前，基于此原理測定農殘的方法主要有速測卡法＼[11＼]、分光光度法＼[12，13＼]、pH法＼[13＼] 、酶生物傳感器法＼[14＼]。然而，前3種方法靈敏度過低，且極易受樣品基質干擾而出現假陽性結果； 酶生物傳感器法雖然其靈敏度較高，但步驟多且繁瑣。與現有方法相比，質譜儀因具有快速、準確、靈敏、抗基質干擾能力強等多方面優勢，已開始用于酶活測定。如Xu等＼[15＼]采用基質輔助激光解析離子化傅立葉變換質譜（MALDIFTMS），通過測定AChE底物及其產物的含量實現了酶活的測定，建立了基于此技術的有機磷農藥篩查方法＼[16～18＼]，這種方法具有快速、高通量、高靈敏度的優勢，但由于MALDIFTMS儀器成本高昂，普及率低，方法難以推廣應用。另外，目前還未見基于此原理的質譜法測定氨基甲酸酯類農藥的報道。本實驗采用已較為普及的電噴霧質譜（ESIMS），建立基于酶抑制原理的快速篩查蔬菜中氨基甲酸酯類農藥殘留的新方法，該法在滿足快速、靈敏、高通量要求的同時，大大降低了篩查成本，便于方法的推廣應用。迄今為止，采用ESIMS，通過測定AChE活性，快速篩查CBPs的方法尚未見報道。