雞源大腸桿菌的耐藥性監測與分析

張玉果,馮海光

(1.邯鄲市神康藥業有限公司,河北邯鄲056011；2.河南省鶴壁市山城區畜牧局，河南鶴壁458000）

雞大腸桿菌病是由埃希氏大腸桿菌(E.coli)的某些致病性菌株所引起的多種疾病的總稱，也是對養雞業危害嚴重及常見的一種細菌性疾病，臨床癥狀和病理變化多變,且多與病毒性疾病和其他細菌性疾病并發,給養雞業造成了嚴重的經濟損失。隨著我國畜牧業的發展,盲目大量濫用抗生素現象普遍發生。有的養雞場從購入雛雞開始就不斷喂服抗菌藥物,直至出欄上市為止,還有的養雞場在飼料中不合理地混合添加抗菌藥物,免疫注射時也給予大量的抗菌藥物,導致大腸桿菌的耐藥菌株不斷出現,耐藥譜不斷擴大,一旦發病,很多藥物都難以奏效;同時也加劇了抗菌藥物在畜禽體內的殘留,給我國畜牧業的持續發展和人類的身體健康帶來潛在危害。這就需要對雞源大腸桿菌進行藥敏試驗，以便準確有效地篩選出高敏藥物進行治療。

近年來，埃希氏大腸桿菌的耐藥性呈上升趨勢。20世紀50年代禽致病性埃希氏大腸桿菌幾乎沒有耐藥性產生，而60年代的分離株對鏈霉素、四環素產生了耐藥性，20世紀70年代對氨芐西林、氯霉素、磺胺甲基異惡唑等產生了耐藥性，80年代至90年代初對阿莫西林、慶大霉素、卡那霉素、萘啶酸、頭孢塞吩等產生了耐藥性。隨著時間的推移,埃希氏大腸桿菌的耐藥率大幅度上升,多重耐藥菌株劇增,耐藥譜增寬,臨床上分離的埃希氏大腸桿菌對環丙沙星的耐藥性已居耐藥性的首位。據報道，微生物對大多數喹諾酮類藥物的耐藥率達10%以上，而在歐美等發達國家,埃希氏大腸桿菌對喹諾酮類藥物均很敏感,耐藥率一般只有5%左右；在我國部分地區埃希氏大腸桿菌對大多數喹諾酮類藥物的耐藥率卻高達40%以上。產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)的埃希氏大腸桿菌現已分布全球各個角落,它們的流行呈增長趨勢,也導致埃希氏大腸桿菌對β-內酰胺類抗生素的耐藥性遍及全世界。

大腸桿菌抗原性復雜、血清型多樣，特別是在規模化養雞業的迅速發展下，雞源大腸桿菌新的血清型又在不斷出現，且其不同的菌株對同一種抗菌藥物的敏感性也不相同，使得抗菌藥物的防治效果越來越差，獸醫工作者不能很好地掌握藥物對其的敏感程度。因此，對雞源大腸桿菌的耐藥性進行監測與分析,對于指導臨床合理用藥及控制本病的流行非常重要。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 培養基：普通營養瓊脂培養基和麥康凱瓊脂培養基，北京雙旋微生物培養基制品廠生產。

1.1.2 藥敏試紙片：由鶴壁市山城區動物疫病預防控制中心提供。

1.1.3 菌株：由鶴壁市動物疫病預防控制中心提供（20株）。

1.1.4 器材：恒溫培養箱、培養皿、接種環、酒精燈、顯微鏡、移液器、滴頭、鑷子、標簽、記號筆、直尺。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的制備

稱取普通營養瓊脂45克、麥康凱瓊脂23克，分別置于兩個潔凈三角燒瓶中,然后各加入滅菌蒸餾水1000毫升、500毫升，加熱煮沸溶解后放入高壓蒸汽鍋內121℃滅菌20分鐘；當瓊脂溫度降到55℃時，在超凈工作臺上分別均勻地倒入滅菌的平皿內,每個滅菌的平皿倒入15毫升，待凝固后置37℃恒溫箱中培養18小時；放入4℃冰箱保存備用。

1.2.2 菌株的培養

用接種環釣取少許菌株，常規劃線接種于普通營養瓊脂培養基上,進行純培養。而后釣取純培養的菌落接種于麥康凱瓊脂培養基上,37℃培養24小時,見生長出磚紅色菌落;再挑取純培養的菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢，呈單個散在或成對的革蘭氏陰性紅色小桿菌。根據上述細菌培養特性和染色鏡檢，可初步驗證為大腸桿菌,純培養菌落備用。

1.2.3 試驗操作方法——藥敏片法

藥敏試驗：按WHO推薦的藥敏片法進行。本法是根據抑菌環直徑大小來判定細菌對抗菌藥物的高敏、中敏、耐藥的方法。該方法的優點是操作簡單、易于掌握;缺點是費時，只能進行半定量測定。

用接種環釣取l環純培養的大腸桿菌，置于1毫升滅菌生理鹽水中，充分混勻后用滅菌吸管吸取此液，均勻的布滿于普通營養瓊脂培養基的整個表面；待營養瓊脂表面稍作干燥后，用滅菌鑷子取各種藥敏紙片均勻貼到營養瓊脂表面,(為保證藥敏紙片與營養瓊脂培養基表面完全接觸，各個藥敏紙片都應用滅菌鑷子輕壓一下）每個平板放6張藥敏試紙片，37℃培養24小時；觀察結果，用直尺測定抑菌圈的直徑。整個操作過程都應注意無菌操作，避免雜菌污染。

1.2.4 判定標準

按抑菌圈的直徑大小作為敏感性高低的判斷標準。抑菌圈大表明細菌對該藥物的敏感性高，耐藥性低；反之，則表明細菌對該藥物的敏感性低，耐藥性高。藥敏紙片的種類及判定標準見表1。

表1 藥敏紙片的種類及判定標準

2 試驗結果與分析

2.1 20株雞源大腸桿菌菌株來源情況見表2

表2 20株雞源大腸桿菌菌株的來源情況

2.2 20株雞源大腸桿菌對12種藥物的耐藥情況見表3

由表3可以看出，20株雞源大腸桿菌對12種抗菌藥物都有不同程度的耐藥性。青霉素、四環素對其完全沒有作用，全部耐藥；紅霉素、利福平對其作用也很小，沒有對其產生高敏；而阿米卡星、頭孢曲松和頭孢唑啉的敏感性較高。具體統計結果見表4。

表3 20株雞源大腸桿菌對12種藥物耐藥情況

由表4可以看出：對雞源大腸桿菌產生嚴重耐藥性的藥物依次是青霉素、四環素、林可霉素、環丙沙星、紅霉素、蒽諾沙星，這6種藥物的耐藥率都大于50%，耐藥最為嚴重的是青霉素，達到了100%；對大腸桿菌中度敏感的藥物依次是：頭孢唑啉、諾氟沙星、卡那霉素，中敏率分別是60%、55%、50%；高敏的藥物分別是：氟苯尼考、頭孢曲松、阿米卡星，高敏率分別是70%、65%、60%。

2.3 不同地區分離菌株耐藥性比較見表5

由表5中可以看出，不同地區雞源大腸桿菌的耐藥情況不同，敏感藥物也不一樣，因此應根據各地的實際情況合理用藥。

3 討論

從試驗結果看，大多數雞場的大腸桿菌存在著廣泛的耐藥性，這給藥物治療帶來了很大的難度，造成這種局面與下列因素有關：養殖戶用藥過程中選藥、劑量、療程不當；存在嚴重濫用藥物現象，常常在未確定病因的情況下，大量使用各種各樣的抗菌藥；目前獸藥市場相當混亂，同一有效成分命名五花八門，誤導了專業戶；假冒偽劣獸藥產品充斥市場，個別獸藥廠家產品的有效成分含量不足，標記的劑量、療程常不能達到治療效果。

3.1 大腸桿菌耐藥性產生的機制

表4 藥敏試驗結果統計

表5 不同地區分離菌株耐藥性比較

3.1.1 一是先天性獲得，主要是由于其細胞壁的結構特點決定，先天性獲得耐藥性的變化一般不大。

3.1.2 二是后天性獲得，主要是由于耐藥性質粒的產生，如：R質粒。R質粒的主要特征：一是能通過細菌與細菌間的接觸，由耐藥菌株轉移到敏感菌株，從而使原來的敏感菌株獲得耐藥性；另一特征是有自我復制的功能，在細胞分裂時，R質粒也同時進行復制從而使子細胞也帶有耐藥質粒。R質粒的耐藥機制有：質粒基因編碼產生各種鈍化酶分解抗生素；耐藥性質?？刂埔恍┘毦募毎ねㄍ感裕箍咕幬锊荒苓M入細菌體內，從而使細菌具有耐藥性；耐藥質粒的基因編碼產生一些特殊的酶，阻止抗生素與細胞內靶子結合而產生抗藥性。R質粒的傳播是細菌產生耐藥性的重要原因之一，特別是在規?；B殖條件下，R質粒更易在細菌之間傳播，造成耐藥菌株的廣泛產生。

3.2 解決其耐藥性的對策

3.2.1 合理用藥、謹慎用藥和正確使用抗菌藥物

在臨床選用抗菌藥物治療雞大腸桿菌病時，要考慮本場的用藥習慣，選擇少用或未曾用過的藥物，避免單一和長期重復使用同一種抗菌藥物。一旦選定了正確的抗生素，下一步就要確定準確的藥物劑量、頻率和療程。最好在分離病原菌的基礎上先做藥敏試驗，選用高敏藥物，這樣才能達到理想的治療效果。

另外，在選擇高敏藥物進行治療時，還要考慮這些高敏藥物的吸收途徑，因為我們所做的藥敏試驗是藥液直接和細菌接觸，而在給雞用藥時，必須通過機體的吸收才能使藥物達到一定的效果，所以在給雞用藥時，高敏藥物一定要配合適宜的給藥途徑，這樣才能達到最好的治療效果。

3.2.2 聯合用藥

主要是利用抗菌增效劑與某些藥物的協同作用。通過聯合用藥可以擴大抗菌譜，增強療效、減小藥物用量、降低或避免毒副作用，進而減少或延緩耐藥菌株的產生。

3.2.3 應用中草藥治療

許多中草藥具有抑制和殺滅細菌作用，清熱解毒類中藥也廣泛用于防治感染類疾病，并具有較好療效和較低毒副殘留及抗藥性等優點。

3.2.4 應用微生態制劑治療

微生態制劑可以促進雞體內正常微生物菌群的建立，使得正常菌群占據整個消化道，而后進入的致病菌就難以在消化道壁上找到附著點，從而競爭性地抑制了致病性大腸桿菌的生存。

4 小結

4.1 對鶴壁市動物疫病預防控制中心提供的20株雞源大腸桿菌菌株進行藥敏試驗結果表明：青霉素、四環素、林可霉素、環丙沙星、紅霉素、蒽諾沙星嚴重耐藥；頭孢唑啉、諾氟沙星、卡那霉素中敏；氟苯尼考、阿米卡星、頭孢曲松高敏，因此，臨床上應選擇上述高敏藥物進行治療。

4.2 近年來，由于人們對抗生素的廣泛大量應用，使得一些藥物過去有效而現在無效；或者在這個雞場有效而在另外一個雞場無效；并且其產生耐藥性的速度也比較快。因此，在臨床用藥過程中我們應當先做藥敏試驗，篩選出高敏藥物，且選擇正確的給藥途徑，將這些高敏藥物交替或聯合使用，同時大力推廣應用中草藥和微生態制劑進行治療，再配合科學的飼養管理和加強環境消毒等措施，以達到最佳的治療效果，從而減少其耐藥機率的發生。