白藜蘆醇對慢性阻塞性肺疾病大鼠核因子κB的抑制作用

張明燈

[摘要] 目的 探討白藜蘆醇對慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠核因子NF-κB的抑制作用，從而闡明白藜蘆醇的抗炎作用機制。 方法 用丙烯醛霧化吸入構建COPD大鼠模型。不同濃度的白藜蘆醇（5、15、45 mg/kg）預處理COPD大鼠模型，逆轉錄PCR法檢測不同濃度白藜蘆醇對COPD大鼠模型肺組織核因子NF-κB的抑制作用。 結果 不同濃度的白藜蘆醇顯著抑制COPD大鼠模型肺組織炎癥因子NF-κB的水平。 結論 白藜蘆醇通過抑制炎癥因子NF-κB的水平從而對COPD模型大鼠肺組織發揮抗炎作用。

[關鍵詞] 慢性阻塞性肺疾病；白藜蘆醇；核因子-κB；抗炎

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）10（b）-0014-03

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種慢性氣道炎癥性疾病，氣道炎癥可引起氣管黏膜充血水腫、黏液分泌增多、氣管平滑肌痙攣，最終導致氣流受限及肺結構破壞[1]，抑制炎癥反應成為治療COPD的重要靶點。植物多酚白藜蘆醇（resveratrol，Res）具有顯著的抗氧化、抗炎和抗衰老等生物學效應，在COPD、支氣管哮喘、肺纖維化等肺部炎癥性疾病中具有抗炎保護作用[2]。霧化吸入丙烯醛可以誘導產生COPD SD大鼠模型[3]，本實驗通過檢測不同濃度白藜蘆醇對COPD大鼠模型肺組織炎性炎癥因子NF-κB的mRNA表達的抑制作用，探討白藜蘆醇對COPD大鼠模型肺組織是否具有抗炎機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

主要儀器和試劑：Bio-Rad ChemiDoc XRS凝膠圖像分析系統（美國Bio-Rad公司）、PCR儀（Bio-Rad公司）、電泳儀（北京賽因坦科技有限公司）；白藜蘆醇（批號：R4080）、NF-κB的基因引物（上海生物工程公司合成）；丙烯醛（購自美國Sigma公司，批號A2635）；Trizol RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒（美國Invitrogen公司）。

實驗動物：昆明醫科大學實驗動物中心提供的50只SD雄性大鼠（SPF級），體重為（400±25）g。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及造模 SD雄性大鼠50只（SPF級），按照隨機數字表法分成5組，每組10只，分別為對照組、COPD模型組、白藜蘆醇低劑量預防組、白藜蘆醇中劑量預防組、白藜蘆醇高劑量預防組。使用規格為35 cm×40 cm×50 cm的動物熏吸箱（課題組自制），將各組大鼠分別放入其中，然后采用蒸餾水分別對模型組、對照組大鼠灌胃，1 h后對模型組進行丙烯醛（6.87 μg/L）霧化吸入，而對照組采用蒸餾水霧化吸入。預防組分別用低、中、高劑量白藜蘆醇灌胃，給藥1 h后，分別進行丙烯醛霧化吸入，5 mg/（kg·d）、15 mg/（kg·d）、45 mg/（kg·d）分別標記為低、中、高劑量。上下午2次霧化吸入，每次持續2 h， 間隔5 h，5 d/周，共120 d。

1.2.2 大鼠肺組織中炎癥因子NF-κB表達量的變化 水合氯醛麻醉大鼠后取出肺組織，按照TRNzol RNA提取試劑盒步驟進行總RNA的提取、cDNA的合成、目的片段的擴增（PCR法）。反應條件：NF-κB預變性15 min（95℃），變性15 s（95℃），退火25 s（60℃），延伸20 s，循環45次。GAPDH：預變性15min（95℃），變性15 s（95℃），退火25 s（60℃），延伸20 s（72℃），45次循環。PCR反應產物在瓊脂糖膠電泳45 min，凝膠圖像分析系統采集圖像，Quantity one4.4.0計算各條帶的熒光強度值及其與GAPDH的比值、引物序列及其產物長度（表 1）。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0 統計學軟件對數據進行分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

模型組、白藜蘆醇預防組NF-κB的mRNA水平與對照組比較均增高，差異有統計學意義（P<0.05）；白藜蘆醇低、中和高劑量預防組NF-κB的mRNA水平與模型組比較均降低，差異有統計學意義（P<0.05） （圖1、圖2、表2）。

圖1 PCR檢測不同劑量白藜蘆醇抑制丙烯醛誘導肺組織中

NF-κB的表達

圖2 不同劑量的白藜蘆醇抑制丙烯醛誘導肺組織中NF-κB的

表達水平

與模型組比較，#P<0.05；與對照組比較，*P<0.05

表2 不同劑量的白藜蘆醇抑制丙烯醛誘導肺組織中NF-κB的

表達水平（pg/ml，x±s）

與模型組比較，#P<0.05；與對照組比較，*P<0.05

3 討論

炎癥反應導致小氣道纖維化和肺泡破壞，這是COPD發病的核心因素。參與COPD炎癥反應的炎癥因子較為復雜，其中NF-κB調節包括細胞因子、黏附分子、急性期蛋白、轉錄因子和調節因子等大量基因和炎癥反應相關基因的轉錄，是促炎癥基因表達的重要樞紐。NF-κB活化后可促進炎癥相關蛋白的表達，因此阻止NF-κB活化成為減輕COPD炎癥反應的關鍵所在。

白藜蘆醇為多酚類植物抗毒素，存在于花生、松樹、葡萄、桑葚等植物體中，自然界分布廣泛，具有抗炎[4]、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤[5]、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化、免疫調節等作用。白藜蘆醇能夠在COPD、支氣管哮喘、肺纖維化和肺動脈高壓等肺部炎癥性疾病中發揮抗炎、抗氧化等生物學作用[6]。

本研究中，COPD模型組、白藜蘆醇預防組肺組織NF-κB的mRNA水平均增高，而采用不同劑量白藜蘆醇干預后，大鼠肺組織NF-κB的mRNA表達下降，提示白藜蘆醇能夠發揮抗炎效應。有文獻報道，白藜蘆醇可以抑制體內促炎癥基因表達的樞紐——NF-κB的激活[7]，下調iNOS、TNF-α等炎性因子的基因表達，發揮抗炎效應。有研究提示白藜蘆醇能夠負調控核因子-κB，減輕COPD炎癥細胞活化和IL-8、粒細胞-巨噬細胞集落因子等炎癥因子的釋放[8]。抑制NF-κB活性成為控制COPD炎癥反應的重要靶點。

NF-κB參與調節急性期蛋白、黏附分子、細胞因子、調節因子等免疫應答、炎癥反應相關因子的表達，同時活化后的NF-κB能夠增強炎性蛋白的表達。NF-κB的活化與COPD的發生、發展密切相關，近年來的研究證實COPD是一種全身炎癥性疾病，因此抗炎治療在COPD的治療中有著舉足輕重的地位。

大量研究報道了白藜蘆醇抗炎作用的分子機制，白藜蘆醇可通過抑制NF-κB活化減輕糖尿病大鼠血管炎癥反應及巨噬細胞聚集[9]；白藜蘆醇通過NF-κB途徑阻滯兔關節軟骨凋亡[10]，提示白藜蘆醇能夠下調NF-κB的表達，這與本研究結果相符合，白藜蘆醇抑制NF-κB的具體機制有待進一步研究。

綜上所述，NF-κB是調節COPD炎癥反應的關鍵樞紐，而白藜蘆醇能夠在轉錄水平抑制NF-κB基因的表達，封閉炎癥反應過程。進一步探討白藜蘆醇干預炎癥反應的可能機制，可為防止COPD提供新思路。隨著白藜蘆醇生理、藥理活性的深入研究，其有望成為防治COPD的新型藥物，將減輕COPD給患者帶來的沉重負擔[11]，具有廣泛的應用前景。

[參考文獻]

[1] Vestbo J，Hurd SS，Agustí AG，et al.Global strategy for the diagnosis，management，and prevention of chronic obstructive pulmonary disease：GOLD executive summary[J].Am J Respir Crit Care Med，2013，187（4）：347-365.

[2] Lee M，Kim S，Kwon，OK，et al.Anti-inflammatory and antiasthmatic effects of resveratrol，a polyphenolic stilbene，in a mouse model of allergic asthma[J].Int Immunopharmacol，2009，9（4）：418-424.

[3] Moretto N，Volpi G，Pastore F，et al.Acrolein effects in pulmonary cells：relevance to chronic obstructive pulmonary disease[J].Ann N Y Acad Sci，2012，（1259）：39-46.

[4] Chalal M，Klinguer A，Echairi A，et al.Antimicrobial activity of resveratrol analogues[J]. Molecules，2014，19（6）：7679-7688.

[5] Carter LG，D'Orazio JA，Pearson KJ.Resveratrol and cancer：focus on in vivo evidence[J]. Endocr Relat Cancer，2014，21（3）：R209-R225.

[6] Knobloch J，Hag H，Jungck D，et al.Resveratrola impairs the release of steroid-resistant cytokines from bacterial endotoxin-exposed alveolargic asthma[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol，2011，109（2）：138-143.

[7] Siedlinski M，Boer JM，Smit HA，et al.Dietary factors and lung function in the general population：wine and resveratrol intake[J].Eur Respir J，2012，39（2）：385-391.

[8] Knobloch J，Sibbling B，Jungck D，et al.Resveratrol impairs the of steroid-resistant inflammatory cytokines from human airway smooth muscle cells in chronic obstructive pulmonary disease[J].J Pharmacol Exp Ther，2010，335（3）：788-798.

[9] Guo R，Liu B，Wang K，et al.Resveratrol ameliorates diabetic vascular inflammation and macrophage infiltration in db/db mice by inhibiting the NF-κB pathway[J].Diab Vasc Dis Res. 2014，11（2）：92-102.

[10] Eo SH，Cho H，Kim SJ.Resveratrol inhibits nitric oxide-induced apoptosis via the NF-kappa B pathway in rabbit articular chondrocytes[J].Biomol Ther（Seoul），2013，21（5）：364-370.

[11] Slok AH，In T Veen JC，Chavannes NH，et al.Effectiveness of the assessment of burden of chronic obstructive pulmonary disease（ABC）tool：study protocol of a cluster randomised trial in primary and secondary care[J].BMC Pulm Med，2014，（14）：131.

（收稿日期：2014-07-18 本文編輯：祁海文）

NF-κB參與調節急性期蛋白、黏附分子、細胞因子、調節因子等免疫應答、炎癥反應相關因子的表達，同時活化后的NF-κB能夠增強炎性蛋白的表達。NF-κB的活化與COPD的發生、發展密切相關，近年來的研究證實COPD是一種全身炎癥性疾病，因此抗炎治療在COPD的治療中有著舉足輕重的地位。

大量研究報道了白藜蘆醇抗炎作用的分子機制，白藜蘆醇可通過抑制NF-κB活化減輕糖尿病大鼠血管炎癥反應及巨噬細胞聚集[9]；白藜蘆醇通過NF-κB途徑阻滯兔關節軟骨凋亡[10]，提示白藜蘆醇能夠下調NF-κB的表達，這與本研究結果相符合，白藜蘆醇抑制NF-κB的具體機制有待進一步研究。

綜上所述，NF-κB是調節COPD炎癥反應的關鍵樞紐，而白藜蘆醇能夠在轉錄水平抑制NF-κB基因的表達，封閉炎癥反應過程。進一步探討白藜蘆醇干預炎癥反應的可能機制，可為防止COPD提供新思路。隨著白藜蘆醇生理、藥理活性的深入研究，其有望成為防治COPD的新型藥物，將減輕COPD給患者帶來的沉重負擔[11]，具有廣泛的應用前景。

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[9] Guo R，Liu B，Wang K，et al.Resveratrol ameliorates diabetic vascular inflammation and macrophage infiltration in db/db mice by inhibiting the NF-κB pathway[J].Diab Vasc Dis Res. 2014，11（2）：92-102.

[10] Eo SH，Cho H，Kim SJ.Resveratrol inhibits nitric oxide-induced apoptosis via the NF-kappa B pathway in rabbit articular chondrocytes[J].Biomol Ther（Seoul），2013，21（5）：364-370.

[11] Slok AH，In T Veen JC，Chavannes NH，et al.Effectiveness of the assessment of burden of chronic obstructive pulmonary disease（ABC）tool：study protocol of a cluster randomised trial in primary and secondary care[J].BMC Pulm Med，2014，（14）：131.

（收稿日期：2014-07-18 本文編輯：祁海文）

NF-κB參與調節急性期蛋白、黏附分子、細胞因子、調節因子等免疫應答、炎癥反應相關因子的表達，同時活化后的NF-κB能夠增強炎性蛋白的表達。NF-κB的活化與COPD的發生、發展密切相關，近年來的研究證實COPD是一種全身炎癥性疾病，因此抗炎治療在COPD的治療中有著舉足輕重的地位。

大量研究報道了白藜蘆醇抗炎作用的分子機制，白藜蘆醇可通過抑制NF-κB活化減輕糖尿病大鼠血管炎癥反應及巨噬細胞聚集[9]；白藜蘆醇通過NF-κB途徑阻滯兔關節軟骨凋亡[10]，提示白藜蘆醇能夠下調NF-κB的表達，這與本研究結果相符合，白藜蘆醇抑制NF-κB的具體機制有待進一步研究。

綜上所述，NF-κB是調節COPD炎癥反應的關鍵樞紐，而白藜蘆醇能夠在轉錄水平抑制NF-κB基因的表達，封閉炎癥反應過程。進一步探討白藜蘆醇干預炎癥反應的可能機制，可為防止COPD提供新思路。隨著白藜蘆醇生理、藥理活性的深入研究，其有望成為防治COPD的新型藥物，將減輕COPD給患者帶來的沉重負擔[11]，具有廣泛的應用前景。

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[6] Knobloch J，Hag H，Jungck D，et al.Resveratrola impairs the release of steroid-resistant cytokines from bacterial endotoxin-exposed alveolargic asthma[J].Basic Clin Pharmacol Toxicol，2011，109（2）：138-143.

[7] Siedlinski M，Boer JM，Smit HA，et al.Dietary factors and lung function in the general population：wine and resveratrol intake[J].Eur Respir J，2012，39（2）：385-391.

[8] Knobloch J，Sibbling B，Jungck D，et al.Resveratrol impairs the of steroid-resistant inflammatory cytokines from human airway smooth muscle cells in chronic obstructive pulmonary disease[J].J Pharmacol Exp Ther，2010，335（3）：788-798.

[9] Guo R，Liu B，Wang K，et al.Resveratrol ameliorates diabetic vascular inflammation and macrophage infiltration in db/db mice by inhibiting the NF-κB pathway[J].Diab Vasc Dis Res. 2014，11（2）：92-102.

[10] Eo SH，Cho H，Kim SJ.Resveratrol inhibits nitric oxide-induced apoptosis via the NF-kappa B pathway in rabbit articular chondrocytes[J].Biomol Ther（Seoul），2013，21（5）：364-370.

[11] Slok AH，In T Veen JC，Chavannes NH，et al.Effectiveness of the assessment of burden of chronic obstructive pulmonary disease（ABC）tool：study protocol of a cluster randomised trial in primary and secondary care[J].BMC Pulm Med，2014，（14）：131.

（收稿日期：2014-07-18 本文編輯：祁海文）