過氧化物酶增殖物激活受體—γ和核因子E2相關因子—2在腎臟衰老中的作用

葉婷+寧勇

[摘要] 目的 探討過氧化物酶增殖物激活受體-γ（PPARγ）和核因子E2相關因子-2（Nrf2）在腎臟衰老中的作用。方法 以3個月齡和24個月齡大鼠作為青年組和衰老組（n = 10），PAS染色觀察腎臟組織病理改變，腎臟組織勻漿測定H2O2、丙二醛（MDA）含量，Western Blot法檢測腎臟組織髓過氧化物酶（MPO）、PPARγ和Nrf2蛋白質表達。 結果 衰老組大鼠腎臟組織MDA[（44.42±4.17）μmol/mg比（26.23±1.43）μmol/mg]、H2O2[（239.90±39.38） μmol/μg比（110.00±19.49）μmol/μg]含量較青年組均明顯增加，差異有統計學意義（P < 0.01、P < 0.05）；衰老組腎臟組織MPO蛋白質表達較對照明顯升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01），而PPARγ蛋白表達則明顯下降，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。兩組間Nrf2蛋白表達差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 氧化損傷在腎臟衰老中發揮重要作用，可能是通過PPARγ表達下降介導。

[關鍵詞] 腎臟衰老；氧化應激；過氧化物酶增殖物激活受體-γ；核因子E2相關因子-2

[中圖分類號] R3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2014）10（c）-0004-04

Role of peroxisome proliferator-activated receptor–γ and nuclear factor-E2-related factor-2 on kidney aging

YE Ting1 NING Yong2

1.Department of Clinic Nutrition， Tongji Hospital， Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology， Hubei Province， Wuhan 430030， China； 2.Department of Nephrology， Tongji Hospital， Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology， Hubei Province， Wuhan 430030， China

[Abstract] Objective To observe the role of peroxisome proliferator-activated receptor gamma （PPARγ） and nuclear factor- E2- related factor-2 （Nrf2） on the kidney aging. Methods Rat aging model was established using 3- month and 24-month old rats as young group and aging group （n = 10）. Renal pathological changes were tested by PAS reaction. The amount of the H2O2 and MDA were tested using kidney homogenate. Western blotting was used to determine the protein expression of MPO， PPARγ and Nrf2. Results Renal MDA [（44.42±4.17） μmol/mg vs （26.23±1.43） μmol/mg] and H2O2[（239.90±39.38） μmol/μg vs （110.00±19.49） μmol/μg] of aging group were significantly higher than those of young group （P < 0.01 and P < 0.05）. Western blotting assay showed that the renal expression of MPO protein of aging group increased apparently compared with young group （P < 0.01）， but PPARγ decreased significantly compared with young group （P < 0.01）. And the expression of renal Nrf2 had no significant difference between two groups （P > 0.05）. Conclusion Oxidative damage plays a role on the kidney aging， which is correlated with the decreasing of PPARγ expression of renal tissue.

[Key words] Kidney aging； Oxidative stress； Peroxisome proliferator-activated receptor gamma； Nuclear factor-E2-related factor-2

衰老是增齡過程中不可避免的結果，往往帶來多個器官功能受損。腎臟是一個血供極其豐富的器官，在衰老過程中腎臟表現最為明顯。氧化損傷在人體衰老中發揮著重要作用。過氧化物酶增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）屬核激素受體超家族成員，除了具有調解脂質和糖代謝、抗炎調解免疫等重要生理功能，近來還發現其在維持氧化還原穩態方面具有重要意義。核因子E2相關因子-2（nuclear factor-E2-related factor-2，Nrf2）是新近發現的又一個在氧化應激中起核心作用的轉錄激活因子。兩者是否也在腎臟衰老中發揮作用鮮有報道。本文擬探討PPARγ和Nrf2在腎臟衰老氧化損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及標本留取

選擇SD雄性大鼠（華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供）20只，常規條件下于實驗動物中心分籠飼養，保持12 h的晝夜循環，室溫控制在23℃左右，濕度維持在40%～50%，自由進食水。將10只大鼠飼養至3個月齡（相當于成人20歲）作為青年組，10只大鼠飼養至24個月齡（相當于成人80歲以上）作為衰老組。斷頭處死放血干凈，生理鹽水沖洗腎臟。一側腎臟迅速縱切分割后，一半置于液氮保存，隨后-80℃保存留待蛋白質檢測中使用，一半留作病理檢查；對側腎臟立即制備組織勻漿。

1.2 方法

1.2.1 腎臟組織病理學分析 腎臟組織石蠟切片（2～3 μm）常規脫蠟入水，行PAS染色，普通光鏡下觀察腎臟組織病理改變。

1.2.2 腎臟組織過氧化氫（H2O2）含量測定 腎臟組織勻漿按照H2O2檢測試劑盒（BioAssay System's peroxide assay kit，Hayward，CA））說明書進行。

1.2.3 腎臟組織丙二醛（MDA）測定 腎臟組織MDA測定采用硫代巴比妥酸法（TBARS）檢測試劑盒（Cat# 10009055，Ann Arbor，MI），操作參照說明書進行。

1.2.4 Western Blot法 Western Blot法檢測髓過氧化物酶（MPO）、Nrf2、PPARγ的蛋白表達水平。分別提取總蛋白和核蛋白，操作參照說明書進行（T-PER？誖Tissue Protein Extraction Reagent和NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents，Thermo Scientific）。各組分別取總蛋白或核蛋白20 μg，進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后電轉移至0.22 μm PVDF膜上。5%的BSA封閉1 h，用MPO（Abcam，ab22604，1∶5000）、Nrf2（Abcam，ab81445， 1∶2000）和PPARγ（Santa Cruz，sc-25591，1∶2000）一抗4℃孵育過夜，用TBST振搖洗膜10 min×3 次，以1∶5000稀釋的羊抗兔生物素標記二抗，室溫孵育2 h后，再次用TBST振搖洗膜10 min×3 次。ECL底物化學發光（Supersignal West Dura Kit，Thermo Scientific）顯色后機器掃描存盤，以Scion Image 軟件進行條帶分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 11.50統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腎臟組織病理學改變

衰老組可見腎小管基底膜增厚皺縮，小管上皮細胞水腫、變性、壞死，部分小管囊狀擴張、萎縮，局灶性小管消失，間質增寬，炎癥細胞浸潤。病變嚴重區域可見系膜增生，節段性腎小球硬化。見圖1。

圖1 腎臟組織病理改變（PAS×400）

2.2 腎臟組織H2O2、MDA含量及MPO蛋白表達情況

衰老組腎臟組織H2O2含量較青年組明顯升高[（239.90±39.38） μmol/μg比（110.00±19.49）μmol/μg]，差異有統計學意義（P < 0.05）。衰老組腎臟組織MDA含量較青年組亦明顯升高[（44.42±4.17）μmol/mg比（26.23±1.43）μmol/mg]，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。與青年組相比，衰老組腎臟組織MPO蛋白表達明顯升高，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見圖2。

2.3 腎臟組織Nrf2、PPARγ蛋白表達

與青年組相比，衰老組腎臟組織Nrf2蛋白表達無顯著性改變，差異無統計學意義（P > 0.05）；而PPARγ表達則明顯下降，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。見圖3。

圖3 腎臟組織Nrf2、PPARγ蛋白表達情況

3 討論

中國將是一個不可逆轉的老齡社會，伴隨老齡化的進程，慢性腎臟病逐年遞增。老年腎臟病的有效防治已成為關系到我國民生的重要公共衛生問題。腎臟是衰老過程中人體器官變化最為明顯的器官之一，正常人在超過40歲后腎小球濾過率平均每年下降1%，形態上表現為體積和重量下降，皮質相對萎縮、腎小球硬化等[1]。衰老是一個極為復雜的過程，受多種因素調控。目前關于衰老的理論主要有自由基學說、線粒體DNA損傷學說、端粒學說和衰老的基因學說等。早在1955年，Harman發表的“衰老的自由基理論”就提出，體內產生過多自由基是引起衰老的重要因素[2]。伴隨增齡，機體抗氧化防御酶體系清除自由基的能力下降，導致體內的自由基代謝紊亂。自由基對機體組織細胞的損傷累積增加，最終導致組織器官形態機能老化，從而促使機體的衰老。

本研究采用24個月齡衰老大鼠作為研究對象，比通常使用D-半乳糖造模更能真實反映衰老變化及其機制。本研究發現，衰老組腎臟組織H2O2及MDA含量明顯增加，提示腎臟氧自由基的產生明顯增加。同時衰老組腎臟組織MPO蛋白質表達也明顯升高，MPO能催化反應生成過量的包括次氯酸在內的氧化劑。這些均提示氧化損傷參與了腎臟衰老的發生，與以往（D-半乳糖造模）研究一致。

PPARγ屬Ⅱ型核激素受體超家族成員，作為一種核受體，與所調控目的基因上游啟動子區的過氧化物酶增殖物反應元件（PPRE）結合后發揮對目的基因轉錄的調控作用，參與調節脂質和糖代謝，具有免疫調節、抗炎等功能。PPARγ還在維持機體氧化還原穩態方面具有重要作用[3-4]。在腎臟缺血再灌注大鼠模型中，PPARγ激動劑匹格列酮能緩解彌漫性腎小管壞死和急性炎性反應，上調SOD1表達，而下調p47phox和p67phox[5]。在慶大霉素和順鉑導致的腎損傷中，PPARγ激動劑均能上調超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等抗氧化酶的表達，減少自由基產生，提高機體抗氧化能力，發揮腎臟保護作用[6-7]。在高同型半胱氨酸誘導血管性癡呆大鼠模型中，PPARγ激動劑可以改善學習、記憶功能，提高大腦中GSH水平，減少自由基產生[8]。在體外衰老模型人二倍體成纖維細胞中，PPARγ表達明顯下降。而給予PPARγ激動劑則能通過調節ERK1/2通路減少H2O2誘導的細胞ROS產生，抑制ICAM-1、MMP-2、MMP-9等炎癥因子表達[9]。PPARγ調節氧化還原狀態的機制，一方面是對NF-κB的抑制作用，另一方面是PPARγ對機體抗氧化酶表達的直接調節作用。以CAT為代表的一些抗氧化酶的啟動子區具有PPRE，PPARγ可以直接結合PPRE，誘導抗氧化酶的基因轉錄與翻譯[10]。在本研究中發現，衰老組大鼠腎臟組織中PPARγ表達明顯下調，因此可能導致其靶目標的抗氧化酶隨之表達不足，導致機體清除自由基的防御能力下降，從而導致腎臟衰老發生。

Nrf2是新近發現的在氧化應激中起核心作用的轉錄激活因子，當受到來源于活性氧或親核劑的信號攻擊后，Nrf2與其胞漿抑制蛋白Keap1解離，轉位進入細胞核，與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）結合，并介導主要抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶，如NAD（P）H：醌氧化還原酶（NQO1）、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、GPx、谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）和血紅素氧化酶（HO-1）等基因的轉錄活性。而抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶是機體清除自由基及內源性和外源性有害物質最主要的酶促系統。因此，Nrf2對于維持機體氧化還原平衡，應對氧化應激有關鍵性作用[11-12]。在衰老血管中，Nrf2和SOD表達下調同時，伴隨著輕度的炎癥狀態和血管舒張功能不全[13]。在衰老小鼠的視網膜色素上皮細胞，給予氧化刺激后細胞Nrf2不能保護性上調，從而導致多種抗氧化酶水平也不能隨之升高，細胞清除自由基功能下降[14]。但在本研究中，衰老大鼠腎臟組織中Nrf2表達無明顯變化。提示腎臟衰老過程中抗氧化能力的減退并不是由Nrf2通路介導。

本研究再次證實自由基過度產生所導致的氧化損傷在腎臟衰老中具有重要意義，而抗氧化防御系統功能減退可能由PPARγ通路介導，而不是由Nrf2通路介導，其具體的機制與作用還需進一步深入探討。

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（收稿日期：2014-07-23 本文編輯：程 銘）

Nrf2是新近發現的在氧化應激中起核心作用的轉錄激活因子，當受到來源于活性氧或親核劑的信號攻擊后，Nrf2與其胞漿抑制蛋白Keap1解離，轉位進入細胞核，與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）結合，并介導主要抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶，如NAD（P）H：醌氧化還原酶（NQO1）、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、GPx、谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）和血紅素氧化酶（HO-1）等基因的轉錄活性。而抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶是機體清除自由基及內源性和外源性有害物質最主要的酶促系統。因此，Nrf2對于維持機體氧化還原平衡，應對氧化應激有關鍵性作用[11-12]。在衰老血管中，Nrf2和SOD表達下調同時，伴隨著輕度的炎癥狀態和血管舒張功能不全[13]。在衰老小鼠的視網膜色素上皮細胞，給予氧化刺激后細胞Nrf2不能保護性上調，從而導致多種抗氧化酶水平也不能隨之升高，細胞清除自由基功能下降[14]。但在本研究中，衰老大鼠腎臟組織中Nrf2表達無明顯變化。提示腎臟衰老過程中抗氧化能力的減退并不是由Nrf2通路介導。

本研究再次證實自由基過度產生所導致的氧化損傷在腎臟衰老中具有重要意義，而抗氧化防御系統功能減退可能由PPARγ通路介導，而不是由Nrf2通路介導，其具體的機制與作用還需進一步深入探討。

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（收稿日期：2014-07-23 本文編輯：程 銘）

Nrf2是新近發現的在氧化應激中起核心作用的轉錄激活因子，當受到來源于活性氧或親核劑的信號攻擊后，Nrf2與其胞漿抑制蛋白Keap1解離，轉位進入細胞核，與抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）結合，并介導主要抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶，如NAD（P）H：醌氧化還原酶（NQO1）、谷胱甘肽S-轉移酶（GST）、GPx、谷氨酸半胱氨酸連接酶（GCL）和血紅素氧化酶（HO-1）等基因的轉錄活性。而抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶是機體清除自由基及內源性和外源性有害物質最主要的酶促系統。因此，Nrf2對于維持機體氧化還原平衡，應對氧化應激有關鍵性作用[11-12]。在衰老血管中，Nrf2和SOD表達下調同時，伴隨著輕度的炎癥狀態和血管舒張功能不全[13]。在衰老小鼠的視網膜色素上皮細胞，給予氧化刺激后細胞Nrf2不能保護性上調，從而導致多種抗氧化酶水平也不能隨之升高，細胞清除自由基功能下降[14]。但在本研究中，衰老大鼠腎臟組織中Nrf2表達無明顯變化。提示腎臟衰老過程中抗氧化能力的減退并不是由Nrf2通路介導。

本研究再次證實自由基過度產生所導致的氧化損傷在腎臟衰老中具有重要意義，而抗氧化防御系統功能減退可能由PPARγ通路介導，而不是由Nrf2通路介導，其具體的機制與作用還需進一步深入探討。

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（收稿日期：2014-07-23 本文編輯：程 銘）