巴西橡膠樹磷饑餓調控基因HbPHR1克隆與生物信息學分析

高樂 覃懷德 何鵬 曾日中

摘 要 天然橡膠主要來源于巴西橡膠樹。海南植膠土壤磷素缺乏，而缺磷會導致橡膠樹生長緩慢、干膠產量降低。本文通過RT-PCR技術從橡膠樹中克隆了一個磷饑餓信號關鍵調控基因HbPHR1，基因全長1 560 bp，包含一個1 476 bp的完整讀碼框（ORF），編碼491個氨基酸，分子量約為53.48 kD。HbPHR1具有MYB結構域和CC結構域，屬于MYB-CC家族成員，為酸性不穩定蛋白，具有較強的親水性。進化樹分析表明，HbPHR1與擬南芥AtPHR1、油菜BnPHR1歸為一個亞類。HbPHR1的克隆對解析橡膠樹磷信號轉導機制、創制磷營養高效利用橡膠樹材料具有重要意義。

關鍵詞 橡膠樹 ；磷饑餓 ；HbPHR1 ；生物信息學

分類號 S794.1

天然橡膠是重要的工業原料和國防戰略物資，主要來源于熱帶樹種——巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）。中國是橡膠消費大國，國內橡膠市場缺口巨大。磷對橡膠樹生長發育、產排膠具有重要的作用。供磷不足，會致使橡膠幼樹葉片數量明顯減少，根系生長不發達，干圍增長十分緩慢；對于已開割橡膠樹，會導致乳膠機械穩定性下降，出現早凝減產，及膠乳干膠產量降低[1]。海南植膠土壤大部分pH值約4.7，屬于典型的酸性土壤，磷肥利用有效性低，低于我國平均利用率15%～25%[2]。以土壤全磷含量低于0.8～1.0 g/kg、速效磷含量50～80 mg/kg的標準來衡量海南膠園土壤磷素供應水平，目前膠園土壤磷素供應水平仍然處于較差狀態[3]。因此提高橡膠樹磷營養的利用效率對提高橡膠樹的產量具有重要作用。前人研究表明，AtPHR1在擬南芥磷信號系統中起關鍵作用。AtPHR1具有MYB結構域（MYB domain）和卷曲螺旋結構域[coiled-coil （CC） domain]，屬于MYB-CC轉錄因子家族成員。AtPHR1功能缺失會導致磷饑餓誘導基因（AtIPS1、AtRNS1和 At4）表達水平下降，葉片累積花青素[4]。AtPHR1以二聚體形式結合到不完全回文序列（GNATATNC）順式作用元件[5]。已有研究表明，許多磷饑餓誘導基因具有該順式作用元件，表明AtPHR1是磷饑餓信號途徑的關鍵調控因子[6]。目前，關于巴西橡膠樹磷信號途徑的研究較少，本文以擬南芥AtPHR1搜索橡膠樹轉錄組數據庫[7]，克隆了橡膠樹磷饑餓信號調控基因HbPHR1，并進行了生物信息學分析。該基因的克隆對橡膠樹磷信號轉導途徑研究及磷養分高效利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為橡膠樹主裁品種‘熱研7-33-97，通過Hoagland營養液進行磷饑餓脅迫水培處理。磷饑餓脅迫處理水培液磷素的濃度為0 mg/L，收集低磷脅迫處理1 d的根部組織材料，液氮速凍后，-70℃保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及cDNA合成

橡膠樹根部組織RNA提取采用Tang等方法提取[8-9]，提取RNA后用DNaseⅠ去除殘留的微量DNA。采用反轉錄試劑盒（Fementas）進行反轉錄合成cDNA。

1.2.2 HbPHR1基因全長的克隆

根據EST拼接的序列設計基因特異性引物：5′端引物：5′-ATGGAGGCACGCCCTGC-3′，3′端引物5′-TTAGGCATCTGTTCTCG-3′。PCR反應的總體系為20 μL，包括1 μL模板、引物各0.4 μL、含MgCl2的緩沖液10 μL、2.5 mmol/L dNTPs Mix 3 μL、1 U的LA Taq DNA聚合酶0.4 μL。PCR擴增程序為95℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，35個循環；72℃ 5 min。1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，TaKaRa凝膠回收試劑盒回收純化目的片段，連接在pMD18-T載體上并轉化大腸桿菌DH 5α，挑取正確的克隆送往廣州英俊生物有限公司測序。

1.2.3 HbPHR1基因生物信息學分析

通過NCBI Blastp軟件進行保守結構域分析，利用在線分析工具ProtParam分析蛋白的理化性質，ProtScale在線分析蛋白的親水性，Tmpred在線分析蛋白跨膜結構域。在 NCBI 網站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載具有MYB-CC結構域的植物蛋白序列，利用ClustalX1.83 和 MEGA5.1軟件進行基因進化樹分析。

2 結果與分析

2.1 HbPHR1基因的克隆

通過HbPHR1基因特異引物擴增出一條1 500 bp左右的條帶（圖1），所擴增的目的條帶與預測的條帶大小一致。將擴增的 DNA 片段回收測序鑒定，確認該基因全長1 560 bp。

2.2 HbPHR1基因序列分析

HbPHR1基因包含一個1 476 bp的完整讀碼框，編碼491個氨基酸，分子量約為53.48 kD。NCBI結構域分析表明，HbPHR1具有MYB（ MYB domain）結構域和CC[coiled-coil （CC） domain]結構域，屬于MYB-CC家族成員，與已知植物PHR1存在較高的同源性（圖2）。ProParam蛋白質的理化分析表明，該蛋白絲氨酸Ser含量最高，為15.7%，其次為谷氨酸Glu（8.4%），含量最低的為半胱氨酸Cys和色氨酸Trp，為1.0%；酸性氨基酸數量（Asp+Glu）為59，堿性氨基酸數量（Arg+Lys）為43，理論等電點pI為5.45，屬于酸性蛋白；不穩定系數（Instability index）為63.47，屬于不穩定蛋白。

2.3 HbPHR1蛋白的疏水性/親水性分析

利用ProtScale預測HbPHR1蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性。依據氨基酸分值越低親水性越強，分值越高疏水性越強的規律，可以看出，多肽鏈第29位具有最高的分值1.489和最強的疏水性；第458位具有最低的分值-3.122和最強的親水性。橡膠樹HbPHR1的整條多肽鏈表現為較強的親水性。

2.4 HbPHR1蛋白的跨膜結構分析

根據TMPred分析，只有超過500分的才被認為顯著。HbPHR1蛋白氨基酸序列分值均低于500分的顯著值，故可推測HbPHR1未含有跨膜結構域。

2.5 HbPHR1進化樹分析

將HbPHR1與MYB-CC家族中的擬南芥、水稻、小麥、衣藻、油菜、菜豆成員進行系統進化樹分析（圖4）。分析結果表明，巴西橡膠樹HbPHR1與擬南芥AtPHR1、油菜BnPHR1歸為一個亞類，與水稻[Os-PHR1（NP_0010

50006）、Os-PHR2（AK100065）]，小麥[Ta-PHR1-A1（KC218925）、Ta-PHR1-B1（KC286910）、Ta-PHR1-D1（KC286911）]相距較遠。

3 討論與結論

PHR蛋白為植物磷信號轉導關鍵調控蛋白，對植物的生長發育起著重要作用。過表達AtPHR1提高了擬南芥莖中磷含量，同時提高了磷轉運子、磷酸酶、RNA酶等磷饑餓誘導基因的表達水平[10]。同時AtPHR1還調控擬南芥根系的生長，AtPHR1功能缺失突變體根毛長度變短，而超表達PHR1可在缺磷條件下促進根毛的生長[11]。水稻中分離了2個與AtPHR1同源的基因OsPHR1和OsPHR2，過表達OsPHR2顯著提高莖葉磷含量，甚至會導致磷中毒。過表達小麥Ta-PHR1-A1可以提高磷的吸收及小麥穗粒數，進而提高小麥產量。本研究在橡膠樹中克隆了PHR基因，基因全長1 560 bp，包含一個1 476 bp的完整讀碼框，編碼491個氨基酸，具有MYB結構域和CC結構域，屬于MYB-CC家族成員。不同品系的橡膠樹在磷利用率上存在基因型的差異[12]。HbPHR1基因的克隆為解析橡膠樹磷信號轉導機制提供了研究基礎，為創制磷營養高效利用橡膠樹材料提拱了基因資源，對提高橡膠樹磷素利用效率，節約磷礦資源，減少環境污染，促進橡膠樹增產具有重要意義。

參考文獻

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