貴州桐梓何首烏rDNA ITS序列分析

許 朋，牛憲立，姬可平

(遵義醫學院珠海校區，廣東 珠海519041)

何首烏(Polygonum multiflorum Thunb)為蓼科植物，分布于河南、四川、貴州、廣東等地區。中草藥何首烏的干燥塊根部分，具有滋補肝腎、益精血、抗氧化、抗腫瘤、降低膽固醇、抑制動脈粥樣硬化、抑菌消炎及增強記憶等多種功效［1］，在臨床上應用十分廣泛。藥用何首烏近緣種包括木藤蓼(Fallopia aubertii)，齒葉蓼((Fallopia denticulate)，毛脈蓼(Fallopia multiflora var.cilliinerve)等，這些近緣種與何首烏不僅在外形上很相似，化學成分也有部分相同，在藥材使用上存在互混、互代、以假充真等現象，因而影響了用藥的安全性和有效性，常規方法很難把它們區分開，所以考慮尋找一種有效的能夠區分何首烏及其近緣種的分子手段［2］，能夠很好的在分子水平上鑒別何首烏。

核糖體rDNA內轉錄間隔區ITS作為一種遺傳標記，具有可遺傳性和可識別性，已經被廣泛應用于中藥材鑒定和品質評價、植物種質資源鑒定、與親緣關系、系統發育等不同方面的研究。目前，越來越多的研究者將ITS應用于藥用植物的鑒別。ITS序列在核基因組中具有高度重復性，總長度只有500～700 bp，具有通用引物，對DNA模板質量要求不高，因此即使不是新鮮材料，從DNA有降解的中藥材上也可順利進行擴增反應［3］。ITS在科屬下使用較多，解決了一些種屬間的關系，還發現ITS在居群間甚至個體間均有變異存在。

近年來，DNA分析技術的發展，PCR測序方法已經被廣泛應用到中藥品種鑒別領域［4－5］。本研究通過采用PCR技術對ITS序列進行擴增測序后運用MEGA5軟件分析比對，并進行遺傳距離分析、構建系統發育樹來比較研究何首烏與其近緣種的遺傳差異，為探討何首烏的系統發育關系和分子鑒定提供分子生物學依據和基礎性資料［6］，對中藥材DNA分子鑒別和野生資源品種的鑒定等具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 實驗樣品

所用實驗材料何首烏于2011年4月采集于貴州桐梓地區，均由牛憲立老師提供。

1.1.2 主要實驗試劑

(1)70%乙醇:量取70 ml的無水乙醇，30 ml雙蒸水，混勻。

(2)3 mol/L NaAc溶液:稱取無水乙酸鈉24.589 g，先加入雙蒸水80 ml加熱溶解，再加雙蒸水定容至100 ml，121℃滅菌20 min，4℃保存。

(3)0.5 mol/L EDTA(pH=8.0):稱取 EDTA－2Na －2H2O18.8 g，加入雙蒸水75 ml，用 NaOH 調pH 至8.0，加雙蒸水定容至100 ml。

(4)0.5 mol/L Tris－HCl(pH=8.0):稱取 Tris 30.27 g，加入雙蒸水 350 ml，用 HCl調 pH 至 8.0，再加雙蒸水定容至500 ml。

(5)TE 液:量取0.5 mol/L Tris－HCl(pH=8.0)4 ml，0.5 mol/L(pH=8.0)EDTA(乙二胺四乙酸)0.4 ml，加入雙蒸水定容至200 ml，分別裝至3個干凈小瓶中，121℃滅菌15min，4℃保存。

(6)CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)提取緩沖液:稱取 CTAB10 g，加 70 ml雙蒸水溶解，再取0.5 mol/L Tris－ HCl(pH=8.0)40 ml，0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)8 ml，5 mol/L NaCl 56 ml，加雙蒸水定容到200 ml，室溫下保存，使用前先加入0.2%的β－巰基乙醇。

(7)5xTBE溶液:稱取Tris(三羥甲基氨基甲烷)16.3 g，硼酸 8.28 g，0.5 mol/L EDTA(pH=8.0)6 ml，加雙蒸水至300 ml，室溫下保存，臨用時稀釋10倍。

(8)氯仿∶異戊醇(24∶1):量取192 ml氯仿，8 ml異戊醇，混勻。

(9)苯酚:氯仿:異戊醇(25∶24∶1):量取 100 ml的苯酚，100 ml氯仿:異戊醇(24∶1)，混勻。

(10)隨機引物、PfuDNA聚合酶、β－巰基乙醇、dNTP、MgCL2。

1.1.3 實驗儀器

本實驗過程中應用到以下儀器 HH－W21.C600電熱恒溫水溫箱(北京長源實驗設備廠)5810R型冷凍高速離心機，WFH－202B紫外透射分析儀(上海精科實業有限公司)，Hema－8000型PCR儀(珠海黑馬儀器廠)島津 UV－2550型紫外分光光度計(日本島津公司)，DYC型電泳儀(北京六一儀器廠)

1.2 方法與步驟

1.2.1 DNA 提取(改良 CTAB 法)

(1)取何首烏干葉片200 mg，剪成小碎片放置于冷研缽中，用液氮迅速研成粉狀(越細越好)，將粉狀物轉入至預冷的1.5 ml干凈離心管中，加入600 μl預熱的CTAB DNA提取緩沖液，充分搖勻，65℃水浴1 h，在水浴過程中每10 min溫和顛倒混勻1次。

(2)取出離心管，使之恢復室溫，加入等體積酚－氯仿－異戊醇(25∶24∶1)輕緩顛倒混勻，室溫下12 000 r/min離心 10 min。

(3)取上清轉移至另一新的1.5 ml離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)輕輕顛倒混勻后9 000 rpm離心15 min。

(4)吸取上清液于另一新的1.5 ml離心管中，加入1/5體積的5 mol/L NaCl溶液，2/3倍體積冷異丙醇，輕輕顛倒混勻，4℃靜置 30 min后，11 000 rpm/min，離心10 min，棄去上清液，用70%乙醇洗滌2－3次，室溫吹干。

(5)將 DNA 溶于500 μl TE，加入5 μl RNA 酶，37℃恒溫水浴箱保溫1 h以裂解RNA。

(6)加入等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)輕緩顛倒混勻，室溫下10 000 r/min離心10 min。

(7)取上清轉移至另一新的1.5 ml離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)輕輕顛倒混勻后6 000 rpm離心15 min。

(8)上清液移入新的離心管中，加入1/10體積的3 mol/L NaAc(pH=5.2)溶液，混勻后加入2倍體積的冰冷的無水乙醇，顛倒混勻，4℃靜置20 min后，11 000 rpm/min，離心 10 min。

(9)倒掉液相，用70%乙醇沖洗2～3次后，在室溫下自然風干，加入適量的TE緩沖液溶解DNA，分裝后放入4℃待用。

1.2.2 DNA純度及片段大小的檢測

DNA樣品稀釋200倍后，在UV－2550紫外分光光度儀上測定其在260 nm、280 nm處吸光度值，根據OD260、OD260/OD280值來判斷DNA的濃度和純度。

DNA濃度計算公式:DNA濃度(μg/ml)=OD260×稀釋倍數×50

運用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測樣品DNA片段的大小，觀察并且拍照。

1.2.3 電泳－瓊脂糖凝膠板配制方法

制備1%的瓊脂糖凝膠(50 ml):稱取0.5 g瓊脂糖于干凈錐形瓶中，再加入50 ml的0.5×TBE。酒精燈加熱煮沸至瓊脂糖全部融化，即得1%瓊脂糖凝膠液［7］。取電泳槽內的有機玻璃內槽洗干凈并晾干模子。將內槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液中加入0.5 μl的核酸染色劑 Goldview，輕輕混勻。小心地倒入有機玻璃板上，使膠液緩緩展開，一直到整個玻璃板的表面形成均勻的膠層。室溫下靜置直到凝膠完全凝固，垂直輕輕拔掉梳子，取下膠帶，將凝膠以及內槽放入電泳槽中。添加0.5×TBE電泳緩沖液至沒過膠板為止。取1 μl上樣緩沖液與DNA樣品混合［7］。用10 μl微量移液槍分別將Marker和樣品加入膠板的樣品槽內，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，正確連接電泳槽和電源，紅色線連接陽極，黑色線連接陰極，電壓80 V，樣品由負極(黑色)向正極(紅色)的方向移動，當溴酚藍移動到距膠板下沿大約1 cm處時，停止電泳［8］。在紫外燈下觀察，DNA存在則有紅色熒光條帶顯示，采用凝膠成像系統拍照并保存。

1.2.4 ITS 擴增和測序

參考White等［9］設計一對通用引物，用于擴增ITS1－5.8S－ITS2完整序列，P1(5’－CGAAG TAAAAGTCGTAACAAGG －3’)位于18 S上，P2(5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’)位于26 S上，由上海生工生物工程技術有限公司合成。采用P1和P2雙引物整段擴增，在50 μL反應體系中，含基因組 DNA1 μL、引物各 1 μL、PfuDNA 聚合酶 2.5U、dNTPs 0.1 mmol·L－1、Mg2+1.5 mmol·L－1。反應條件:PCR擴增條件為94℃預變性5 min，94℃變性2 min，52℃退火3 min，72℃延伸2 min，循環30次;72℃延伸10 min，反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定后，分別送交上海生工和上海英駿廣州分公司做雙向測序。

1.2.5 序列分析

經公司測序的結果進行手工校正，采用MEGA5軟件進行序列比對分析和遺傳距離分析，并用MEGA5軟件繪制NJ系統樹。

2 結果分析

2.1 DNA 濃度

紫外分光光度計檢測何首烏DNA濃度，DNA的OD260/OD280比值為1.714，何首烏 DNA濃度為480 μg/ml。

2.2 PCR擴增產物電泳檢測

何首烏樣品經改良CTAB法提取總DNA，PCR擴增產物(見圖1)，圖譜中樣品條帶清晰，達到實驗要求，可以用來測序。由圖知貴州桐梓何首烏樣品ITS序列的長度在500 bp到750 bp之間。

2.3 測序結果及序列分析

經測序得到何首烏rDNA ITS序列，對測序結果比對發現何首烏rDNA的ITS序列，4種何首烏近緣種ITS序列均來源于Genbank，根據Genbank已報道的近緣種(Genbank登錄號見表1)序列資料確定rDNA內轉錄區ITS1和ITS2與3個編碼區18 S、5.8 S、26 S的界限。何首烏rDNA完全序列片段長度共約652 bp，其中ITS1的長度為202 bp，G+C含量為70.29%，5.8 S的長度為 161 bp，ITS2長度為232 bp，G+C含量為68.97%，何首烏 ITS序列與GenBank中近緣種序列之間的遺傳距離見表2，其中遺傳距離范圍為0.077 0～0.421 1。圖2是貴州桐梓何首烏與GenBank中4種近緣種ITS序列系統發生樹，通過NJ樹可以看出，何首烏單獨為一支，說明何首烏與其近緣種的ITS序列存在較大變異。

圖1 ITS序列PCR擴增產物電泳圖譜Fig.1 gel electrophoresis profiles of PCR amplification products of ITS sequence

經測序得貴州桐梓何首烏rDNA ITS序列依次為:

表1 何首烏近緣種序列來源Table1 Polygonum multiflorum relative sequence source

表2 何首烏與其近緣種遺傳距離Table 2 polygonum multiflorum from different regions of genetic distance

圖2 何首烏及其近緣種rDNA ITS系統發育樹Fig.2 Polygonum multiflorum Thunb and its relative rDNA ITS phylogenetic tree

3 結論與討論

中藥材用于疾病防治已有幾千年的歷史，但由于中藥現代品質監控技術不足，常常出現藥材混淆代用、故意偽制等現象，嚴重影響了臨床用藥的安全性，甚至危及人的生命，尋找健全完善的中藥品質檢測技術迫在眉睫。目前，越來越多的研究者將ITS應用于藥用植物的鑒別，為揭示藥用植物的遺傳差異和鑒定中藥材品種提供了科學依據。

rDNA ITS區段在科、屬、種水平上均有特異性序列的特性，對ITS區進行PCR擴增、測序及序列對比分析后，設計特異性引物來檢測真核生物的方法已越來越被廣泛應用。ITS序列具有相對較快的進化速率，一般用于研究親緣關系較近的屬間關系以及種間甚至居群間的系統關系［10］。rDNA內轉錄間隔區ITS作為一種遺傳標記，具有可遺傳性和可識別性，ITS序列長度適中，人們可以從不太長的序列中獲取足夠信息，被廣泛用于屬內種間或種內群體的系統學研究［11－12］。ITS序列的DNA條形碼鑒定研究日益受到中藥研究工作者的廣泛關注和實際應用［13－14］，ITS序列的進化速率較快、基因片段短、直觀性強、擴增和測序容易，存在種內多態性，已成為中藥現代化研究的一個重要方面，為揭示藥用植物的遺傳差異和鑒定中藥材品種提供了科學依據［15－16］。

為了獲取高質量的DNA，本實驗采用改進的CTAB法對何首烏進行DNA的提取，CTAB是一種有效的陽離子去污劑，可溶解細胞膜，能與蛋白質和多聚糖形成復合物。本實驗利用CTAB在高離子強度的緩沖溶液中與蛋白質和大多數多聚糖形成復合物，但不沉淀核酸的特性，離心獲得含DNA的上清液;用氯仿與異戊醇的混合溶液抽提DNA，去除蛋白質，使蛋白質變性、分層。在抽提過程中，混合使用酚和氯仿抽提效果最好。酚的變性抽提作用要比氯仿好，但酚和水有一定比例的互溶，氯仿的變性作用不如酚的效果好，但氯仿和水不相溶，不會除掉DNA，經酚第一次抽提后水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿互溶，用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚除去;用酚和氯仿抽提DNA時，還要加入少量的異戊醇，因為在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈震蕩離心管數次，導致混合液中容易產生氣泡，氣泡會影響相互間的作用，加入異戊醇能降低分子表面張力，減少抽提過程中泡沫的產生，同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩定。在沉淀DNA時，加入的Na+能中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而使DNA易于聚集沉淀，加入乙醇可以除去鹽離子;加入RNase降解RNA，從而得到純凈的DNA分子，達到提取和純化DNA的目的，從而獲得了高質量的DNA，適合下一步的分子生物學的研究。

本研究通過對序列的比對分析，發現何首烏rDNA ITS序列與GenBank中已有的何首烏近緣種的ITS序列有明顯的差異，說明何首烏與其近緣種間變異較大，通過NJ樹可以將何首烏及其近緣種區分開來。實驗結果表明對ITS序列的比對分析可用以鑒別種屬之間的差異，同時為中藥材鑒別研究提供了新思路;ITS序列可對何首烏及其近緣種做出鑒別，ITS區序列的差異能為鑒別何首烏提供依據。

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